头花蓼中总黄酮的提取及对鸡脯肉的抑菌效果

杨沛，刘碧林，杨洋，赵文婷，黄渝

1.重庆化工职业学院（重庆 401120）；2.太极集团西南药业股份有限公司（重庆 400000）

头花蓼，又名石莽草、四季红，属蓼科植物。主要分布在我国的云南、贵州、四川等地，是贵州省民间著名的常用草药之一[1-2]，具有解毒止痛、消热利尿、活血化瘀的功效。在贵州常用头花蓼的地上部位治疗泌尿系统感染、湿疹、风湿、跌打损伤、腹泻痢疾等症状，可谓是苗族日常生活中的必备药[3-4]。头花蓼的化学成分主要由挥发油、酚酸类、黄酮类化合物组成，其中，黄酮类物质含量占比最大[5]。黄酮类化合物是一种天然的抑菌性物质，且与动植物的亲和性较高。有不少专家和学者研究黄酮类物质的抑菌活性，陈凤清等[6]利用超声波辅助法从丑橘皮中提取总黄酮，并研究其对细菌和真菌的抑菌效果；王宇希[7]采用响应曲面法优化提取丁香叶中黄酮类物质的同时，通过体外抑菌试验，研究黄酮类化合物对猪源性大肠杆菌的抑菌性。试验以苗药头花蓼为原料，提取其中黄酮类物质并研究其对鸡脯肉的抑菌效果。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

头花蓼（贵州威门药业股份有限公司）；纤维素酶（河北吉捷生物科技有限公司）；无水乙醇（分析纯，合肥新都化工有限公司）；石油醚（分析纯，济南广宇化工有限公司）；芦丁（工业纯，珠海祥瑞化工有限公司）；HPD-826型大孔树脂（西安瑞利奥莱化工有限公司）；NaNO2（分析纯，西安蓝翔化工有限公司）；试验菌种（北京百欧博伟生物技术有限公司）。

真空干燥箱（上海舍岩仪器有限公司）；HS-100恒温箱（青岛聚创环保设备有限公司）；SY-BS摇床（上海锦玟仪器设备有限公司）；ZFJ-20粉碎机（江阴市正尚机械有限公司）；CSB-10B超声波清洗器（杭州艾普仪器设备有限公司）；L3-S紫外-可见分光光度仪（浙江赛德仪器设备有限公司）；DW-ADDR10高效液相色谱仪（上海轩仪仪器设备有限公司）；IG-50红外光谱仪（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）；BM-200生物显微镜（北京瑞宏诚科技发展有限公司）。

1.2 头花蓼中总黄酮的提取

将头花蓼的茎、叶采摘下来浸泡于蒸馏水中并洗净，通风自然晒干后于真空干燥箱中充分干燥，利用粉碎机碎成粉末。对粉末进行筛选，留取可通过0.250 mm孔径筛子的粉末备用。

采用纤维素酶对粉末进行预处理，放入100 mL具塞锥形瓶中，加入适量乙醇作为溶剂放入摇床中充分混合2 h，放入超声波清洗器中进行超声提取3 h。过滤出滤渣，滤液放置于250 mL容量瓶中，用80%乙醇稀释并定容。精确吸取10 mL容量瓶中溶液并蒸干，与水复溶后采用石油醚作为萃取剂萃取至溶液上层显示无色时方可停止。分离除去石油醚层，取水相层即得试样溶液。

1.3 总黄酮的测定

以芦丁为标准品参照物，采用分光光度法测定总黄酮。将芦丁加入乙醇中稀释，用NaHCO3溶液调节溶液pH约9.0，加入NaNO2并经Al(NO3)3显色后，在510 nm波长下测定吸光度A。以芦丁质量浓度c为横坐标，吸光度A为纵坐标进行线性拟合，得到回归方程A=0.0114c-0.0235，相关系数r2=0.9994，在10～100 μg/mL质量浓度范围内体现良好线性关系。吸光度与芦丁质量浓度的标准曲线如图1所示。

图1 芦丁浓度-吸光度标准曲线

1.4 大孔树脂纯化总黄酮提取液

将HPD-826型大孔树脂用90%乙醇浸泡1 d，充分溶胀后加入总黄酮提取液中，静置吸附12 h。倒掉剩余的溶液，用去离子水洗净大孔树脂表面残渍后浸入50%乙醇溶液中，设置摇床频率80 r/min进行解吸6 h，测定解吸液的总黄酮。

1.5 黄酮提取物对鸡脯肉的抑菌保鲜

1.5.1 菌悬浮液的制备[8-9]

将低温下菌种接入液体培养基中，在摇床培养（40 ℃，180 r/min）下活化菌种。用接种环取少量活化菌种于无菌水中，稀释一定倍数后用显微镜计数法计数，制成浓度为107CFU/mL的菌悬浮液进行备用。

1.5.2 黄酮提取物对微生物生长的抑制试验

将鸡脯肉绞碎捣烂呈糊状后，菌悬浮液涂布于糊状鸡脯肉培养基表面。用浸泡在NaNO2溶液（0.005 g/mL）中直径5 cm的滤纸片分别沾取不同浓度的黄酮提取物溶液，置于恒温培养箱（40 ℃）48 h后，测定抑菌圈直径、最小抑菌浓度、最低杀菌浓度来判定黄酮提取物对微生物的抑制生长作用。

抑菌圈大小的测定：参照文献[10]，将圆形滤纸片放入灭菌箱中灭菌处理，分别放入不同浓度总黄酮提取液中浸泡15 min。将备用的菌悬浮液加入到规定菌种的培养皿表面，夹取浸泡总黄酮提取液的滤纸片于培养皿中。相同恒温环境中培养菌种，每组试验做3组平行试验，培养48 h测量抑菌圈大小，最终结果以平均值计。

最小抑菌浓度（MIC）的测定[11]：将总黄酮提取液用无水乙醇稀释成不同浓度的溶液，分别取不同浓度提取液于无菌培养皿内，混合倒入相应菌种培养基。完全凝固后分别加入1 mL菌悬浮液，于40 ℃培养48 h，依据菌种生长情况判断各试验组最小抑菌浓度。

最低杀菌浓度（MBC）的测定[12]：无菌条件下，向培养皿中加入PDA培养基，分别吸取不同浓度的总黄酮提取液加入培养基中。将待测菌种均匀涂布于培养基表面进行培养，若培养2 d仍不长菌，试验组中出现这种情况的总黄酮提取液最低浓度即为最低杀菌浓度。

2 结果与讨论

2.1 红外光谱分析

图2为总黄酮提取液的红外光谱分析图。3285 cm-1为酚羟基O—H的伸缩振动吸收峰，2921 cm-1处为—CH2—的反对称伸缩振动吸收峰，2851 cm-1处为—CH2—的对称伸缩振动吸收峰，1614 cm-1处为C＝C结构的伸缩振动峰，1517～1742 cm-1处为羧基和芳环骨架的伸缩振动吸收峰，1140～1300 cm-1处推测为苯酰基结构上C—O和C—C的振动吸收峰，此结构为黄酮所带有的特征结构，说明提取液中含有黄酮类物质。

2.2 HPLC色谱分析

将经大孔树脂纯化后的总黄酮提取液置于高效液相色谱仪中分析，结果如图3所示。在保留时间2.2，3.8，30.7和47.1 min处分别出现一个吸收峰。与参考文献[13-14]比对后，按照保留时间先后顺序确定黄酮类物质：陆地棉苷、槲皮素-3-O-2’’-没食子酰基-鼠李糖苷、槲皮素和山奈酚。总黄酮提取量超过90%，纯度较高。

图3 总黄酮的HPLC图谱

2.3 大孔树脂的解吸条件分析

2.3.1 乙醇体积分数对解吸过程的影响

黄酮类物质易溶于水、乙醇等极性溶剂，选用不同体积分数乙醇作为洗脱剂并测定其解吸率，结果如图4所示。解吸率在乙醇体积分数30%～50%内呈增大趋势，而在50%～80%内呈减小趋势。乙醇体积分数50%时解吸率最大，为76%，故确定洗脱剂体积分数为50%。

图4 洗脱剂浓度与大孔树脂解吸率的关系曲线

2.3.2 摇床频率对解吸过程的影响

摇床频率的大小决定着黄酮类物质摆脱大孔树脂吸附束缚的能力，进而进入乙醇溶液的概率。通常情况下，摇床频率越大，被大孔树脂吸附的物质越容易溢出进入到溶液体系中。摇床频率过大容易导致大孔树脂与容器发生碰撞而使得大孔树脂或容器有所受损。因此，根据图5综合选择摇床频率为80 r/min最佳。

图5 摇床频率与大孔树脂解吸率的关系曲线

2.4 黄酮提取物对鸡脯肉的抑菌效果

2.4.1 总黄酮提取液对不同菌种的抑菌圈直径

以金黄色葡萄球菌、黑曲霉、大肠杆菌、枯草杆菌4种微生物为施用对象，考察不同质量浓度的总黄酮提取物对其抑菌圈直径大小的测定结果，如表1所示。结果表明，总黄酮提取液对4种菌种均表现出一定抑制作用。其中，对金黄色葡萄球菌和黑曲霉的抑制作用明显优于大肠杆菌和枯草杆菌，并且其中对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强。

表1 总黄酮提取液对不同菌种抑菌圈直径测定结果

2.4.2 总黄酮提取液的最小抑菌浓度和最低杀菌浓度

试验中的菌悬浮液主要组成为金黄色葡萄球菌、黑曲霉、大肠杆菌和枯草杆菌，总黄酮提取液作用于试验菌株的效果如表2所示。头花蓼黄酮类物质对各种菌株的抑制作用较为明显。其抑制效果顺序为金黄色葡萄球菌＞黑曲霉＞枯草杆菌＞大肠杆菌，最小抑菌浓度分别为3.40，5.30，6.20和7.30 mg/mL。金黄色葡萄球菌和大肠杆菌是鸡脯肉日常冷藏过程中最常出现的腐败菌种，总黄酮提取液对二者的最低杀菌浓度仅4.60和7.90 mg/mL，可以预见该黄酮提取液对鸡脯肉在冷藏过程中具有良好的抑菌作用。

表2 头花蓼黄酮的最小抑菌浓度和最低杀菌浓度测定结果

3 结论

以头花蓼为试验原料，采用纤维素酶——超声波提取法提取头花蓼中的黄酮类物质，并用大孔树脂进行纯化。红外光谱分析表明存在苯酰基结构，此结构为黄酮所带有的特征结构，说明提取液中含有黄酮类物质。经HPLC色谱分析表明总黄酮提取液的化学组成主要为陆地棉苷、槲皮素-3-O-2’’-没食子酰基-鼠李糖苷、槲皮素和山奈酚，且纯度超过90%。对影响大孔树脂解吸率的乙醇体积分数和摇床频率因素进行探讨，确定洗脱剂乙醇的最佳体积分数50%，摇床频率80 r/min。将黄酮提取物应用于鸡脯肉的抑菌保鲜，对鸡脯肉冷藏过程中由于腐败变质出现的金黄色葡萄球菌、黑曲霉、大肠杆菌、枯草杆菌进行抑菌试验。结果表明，黄酮提取物对金黄色葡萄球菌和黑曲霉的抑制作用明显优于大肠杆菌和枯草杆菌，其中对金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强，4种菌种均随着黄酮质量浓度增大而呈现抑菌圈直径明显减小。最小抑菌浓度分别为3.40，5.30，7.30和6.20 mg/mL，最低杀菌浓度分别为4.60，7.70，7.90和6.70 mg/mL，说明头花蓼黄酮提取液对鸡脯肉具有良好的抑菌作用。