超高效合相色谱在独一味有效成分测定中的应用＊

靳贵林，边 洋，李 雪

（1.西藏藏医药大学 藏医药基础教育部重点实验室，西藏 拉萨 850000；2.西安交通大学，陕西 西安 710000）

2015 版《中国药典》收载独一味为唇形科植物独一味Lamiophlomis rotata (Benth.)Kudo 的干燥地上部分[1]。独一味(Lamiophlomis herba)藏药名“达巴”；《度母本草》：“茎方形，如标尺，叶圆形，有疣状腺点，铺地而生；治疗月经过多，尿闭等症，叶子捣碎涂于伤口，可促进伤口愈合。”《晶珠本草》：“叶圆而厚，茎方，花分紫、黄、白”。现代药理研究显示独一味对于牙龈炎具有很好的疗效[2-3]，对于骨折患者具有镇痛止血作用[4-5]，对于肩周炎、腰腿痛患者具有明显的镇痛效果[6-7]。乙永林[8]认为独一味中桅苷甲酯、木犀草素、芹菜素含量较高可以作为独一味质量评价的指标性成分。郝自新[9]研究提示山桅苷甲酯、8-0-乙酰山桅苷甲酯色谱分离较好，可以作为质量评价指标性成分。昝珂[10]研究显示山桅苷甲酯，8-0-乙酰山桅苷甲酯、木犀草素、芹菜素、绿原酸、芦丁、毛蕊花糖苷、槲皮素等化学成分含量较高，峰位明显。综上所述，以山桅苷甲酯，8-0-乙酰山桅苷甲酯、木犀草素、芹菜素为指标性成分，可以更好地评价独一味质量的优劣。

超高效色谱是一种新的分析方法，广泛用于药物分析和分离[11,12]。超高效色谱中的流动相是超临界二氧化碳，具有气体的扩散特性和液体的密度和流动性[13,14]。在超临界状态下，液态二氧化碳具有较高的分离效率[15,16]。UPC2还具有许多其他优点，例如分析时间短，提取与分离集成在一起，对环境的危害较小[17,18]。最终，UPC2进行了3D 全波长扫描以确定化合物含量，从而克服了单波长检测的局限性。现在，关于独一味的质量评价的报道很多，但是没有基于UPC2的质量评价的详细研究[19,20]。本课题引进新技术超高效合相色谱法，以3D 全波长扫描能够更好地测定各化学成分含量；以山桅苷甲酯为指标性成分，旨在用新技术来建立独一味多指标质量评价分析方法。

1 仪器及供试药材

1.1 仪器与试剂

Waters 超高效合相色谱

水浴锅（郑州长城科工贸有限公司；220v、50HZ1.5KW型号：WB-2000）

旋转蒸发仪（郑州长城科工贸有限公司）

超声仪器（江苏昆声市超声仪器有限公司；220v、100W，Q/320583GSFY008-2006）

AT.Lichom C18 液相分析色谱柱（250mm×4.6mmid.5um）

电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司，AL204-IC）

CO2（食品级9999）

甲醇（山东禹王实业有限公司化工分公司，生产批号：20180373013）

乙腈（山东禹王实业有限公司化工分公司，生产批号：20180514268）

磷酸（天津市大茂化学试剂厂，生产批号xk13-011-00027）

山桅苷甲酯（中国食品药品鉴定研究院，CAS:623-65-8，批号：61222202）

1.2 药材

2019 年，从西藏林芝采集了五批独一味药材，并经甘肃中医药大学杨扶德教授鉴定为正品独一味，药材信息见表1：

表1 药材信息

2 实验部分

2.1 色谱条件

以CO2与甲醇为流动相梯度洗脱，15%甲醇0～1min，18%甲醇1～5min，20%甲醇5～6min，25%甲醇6～7min，30%甲醇7～8min，30%甲醇8～9min，15%甲醇9～10min。柱温，30℃；3D 全波长扫描，进样量1μL、2μL、3μL、4μL、5μL；色谱图如图1 所示，经分析进样量为2μL 色谱图较好。

图1 色谱图

2.2 供试品制备

精密称取过40 目筛，60℃下干燥2h 的独一味供试品1.00g，置于150mL 带塞锥形瓶，加入甲醇50mL，称定重量。超声提取90min，置于室温下冷却，称重加甲醇补充减少量，滤过，取续滤液10mL定容于10mL 容量瓶,待用。

2.3 对照品制备及成分确定

取山桅苷甲酯5mg，置于25mL 容量瓶，用甲醇溶解，定容于25mL,即得0.2mg/mL 的标准品溶液,待用。

2.4 标准曲线绘制

取浓度为0.0015mg/mL、0.003mg/mL、0.0045mg/mL、0.006mg/mL、0.0075mg/mL 山桅苷甲酯标准品溶液，进样2μL 在3D 全波长扫描下进样，计算峰面积，以峰面积为y 轴，样品量为x 轴制作标准曲线。得出山桅苷甲酯标准曲线及r 值见表2。

表2 标准曲线及r 值

2.5 精密度实验

以山桅苷甲酯为特征性成分来检测精密度，取已知浓度的山桅苷甲酯溶液2μL，进样6 次，计算得RSD 值小于2%，故而仪器的精密度较好。

2.6 稳定性实验

精密称取过40 目筛，60℃下干燥2h 的独一味供试品1.00g，按照“2.2 供试品制备”项下提取。提取液用0.25μm 滤膜过滤，在1h、4h、7h、10h、16h、24h分别进样2μL，在3D 全波长扫描下测定山桅苷甲酯峰面积，依据峰面积计算含量，得山桅苷甲酯在24h 内RSD 值为1.5%稳定性较好。

2.7 重复性实验

精密称取过40 目筛，60℃下干燥2h 的独一味供试品1.00g，按照“2.2 供试品制备”项下提取。提取液用0.25μm 滤膜过滤，重复以上实验6 次，分别进样2μL，在3D 全波长扫描下测定山桅苷甲酯峰面积，计算山桅苷甲酯含量，计算得RSD 值小于2%，故而得出实验重现性较好。

2.8 加样回收实验

精密称取过40 目筛，60℃下干燥2h 的独一味供试品1.00g，按照“2.2 供试品制备”项下提取。提取液用0.25μm 滤膜过滤，各加入已知浓度的山桅苷甲酯对照品溶液0.3ug，而后定容于10mL 容量瓶。重复以上实验5 次，用0.25μm 滤膜过滤，取2μL,进样测定山桅苷甲酯面积计算加样回收率，其值见表3。

表3 加样回收率数值

由表3 可知，平均加样回收率为95%，RSD 值小于2%，故而加样回收率较好。

3 独一味中山桅苷甲酯峰位确定

精密称取过40 目筛，60℃下干燥2h 的独一味供试品1.00g，置于50mL 带塞锥形瓶，加入甲醇50mL，称定重量。超声提取90min，置于室温下冷却，称重加甲醇补充减少量，滤过，浓缩，而后定容于10mL 容量瓶。用0.25μm 滤膜过滤，取2μL 进样，得供试品色谱图如图2 所示；

图2 峰1 为山桅苷甲酯峰

4 最佳提取方式选择

4.1 提取溶剂的选择

精密称取过40 目筛，60℃下干燥2h 的独一味供试品1.00g，置于150mL 的6 个带塞锥形瓶，其中5 个锥形瓶中各自加入50%、60%、70%、80%、100%甲醇各50mL，一个锥形瓶中加入50mL 甲醇，称定重量。超声提取90min，计算山桅苷甲酯的含量见表4。

表4 提取溶剂考察

由表4 可知，甲醇提取液中所含山桅苷甲酯含量最高，故而选取独一味的最佳提取溶剂为甲醇。

4.2 提取料液比选择

精密称取过40 目筛，60℃下干燥2h 的独一味供试品1.00g，分别置于4 个150mL 的带塞锥形瓶，分别加入70%乙醇30mL、40mL、50mL、60mL，称定重量。分别超声提取90min，置于室温下冷却，称重加70%乙醇补充减少量，滤过，而后取续虑液10mL于容量瓶中。用0.25μm 滤膜过滤，取2μL 进样，计算独一味中山桅苷甲酯含量见表5。

表5 不同料液比下山桅苷甲酯含量

由表5 分析可知，在料液比为1:3 的情况下山桅苷甲酯的含量最高，故而选择最佳料液比为1:3提取独一味中的山桅苷甲酯。

4.3 超声提取时间的选择

精密称取过40 目筛，60℃下干燥2h 的独一味供试品1.01g，分别置于6 个150mL 的带塞锥形瓶，加入甲醇50mL，称定重量。分别超声提取30min、50min、60min、80min、120min、150min，置于室温下冷却，称重加甲醇补充减少量，滤过，而后取续虑液10mL 于容量瓶中。用0.25μm 滤膜过滤，取2μL 进样，计算独一味中山桅苷甲酯含量见表6：

表6 不同超声提取时间下山桅苷甲酯含量

由表6 可知超声提取90min，提取液中的山桅苷甲酯含量较高，故而选择超声提取时间为90min。

5 独一味中所含山桅苷甲酯含量的测定

精密称取不同月份过40 目筛，60℃下干燥2h的独一味供试品1.00g，按月份编号，每个供试品平行3 次，置于50mL 带塞锥形瓶，加入甲醇50mL，称定重量。超声提取90min，置于室温下冷却，称重加甲醇补充减少量，滤过，而后定容于10mL 容量瓶。用0.45μm 滤膜过滤，取2μL 进样，计算独一味中山桅苷甲酯的含量，其值见表7；

表7 山桅苷甲酯含量

由表7 可知该方法可以有效而准确的测出独一味中山桅苷甲酯的含量，山桅苷甲酯含量在0.53±0.041mg/g 范围内波动。

6 结论

独一味(Lamiophlomis herba)藏药名“达巴”；《度母本草》：“茎方形，如标尺，叶圆形，有疣状腺点，铺地而生；治疗月经过多，尿闭等症，叶子捣碎涂于伤口，可促进伤口愈合。”超高效色谱中的流动相是超临界二氧化碳，具有气体的扩散特性以及液体的密度和流动性，在超临界状态下，液态二氧化碳具有较高的分离效率。UPC23D 全波长扫描克服了单波长检测的局限性，且具有分析时间短，提取与分离一体化，对环境无害等优点。在这项研究中，建立了一种基于UPC2的新的定量分析方法，用于评价独一味的质量品质。