UPLC-PDA联合UPLC-MS/MS法确证一批未知药品中的卡那霉素

魏秀丽，张传津*，张 琦，刘霄飞，张志民，杨志昆

(1.山东省饲料兽药质量检验中心，济南250100；2.山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室，济南250100)；(3.动物源细菌耐药性监测与精准化用药山东省工程实验室，济南250100；4.山东省畜产品质量安全中心，济南250100)

卡那霉素是一种人医临床使用的药物，起初用于抗感染的治疗[1-2]。兽医临床中，有硫酸卡那霉素注射液、单硫酸卡那霉素可溶性粉或注射用硫酸卡那霉素的剂型，已经应用多年。从国家兽药基础数据库中，可以查到曾经有上百个生产批准文号，有部分已经过期，还有变更换新批准文号的生产厂家。对假劣兽药或饲料添加剂的查处，依然是各级主管部门的监督重点。

应客户委托检测一种白色的未知粉末，违法者违规生产，无任何生产信息的标签可查。未知其主要成分。关于卡那霉素的检测方法，查阅相关文献，有蒸发光散射法(HPLC-ELSD)[1-2]、微生物管碟法[3]、柱后衍生化法[4]、电喷雾法(HPLC-CAD)[5-7]、紫外可见分光光度法[8-10]，质谱法[11]等多种方法可以选择；根据实验室现有条件，前期用超高效液相色谱进行筛选后，初步怀疑是卡那霉素，后期建立了未知药品中卡那霉素的测定-超高效液相串联质谱法，本方法通过优化色谱和质谱条件，提高了分离效果，可以作为确证方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 分析天平：感量0.00001 g；仪器Waters AcquityTMUltra performance LC超高效液相色谱仪，Waters Quattro premierXE超高效液相-串联质谱仪，均为Waters公司；0.22 μm的滤膜为Waters 公司。

1.2 药品及试剂 卡那霉素，批号K0071411，773 U/mg；新霉素，批号K0091511，671 U/mg；安普霉素，批号K0231610，571 U/mg；大观霉素，批号K0261705，644 U/mg；四种药物标准品均购买自中国兽医药品监察所；甲酸、乙腈、甲醇均为色谱纯；葡萄糖，分析纯；超纯水。

2 方法与结果

2.1 超高效液相色谱-二极管阵列检测法色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC T3色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)；流动相A：乙腈(0.05%磷酸)；流动相B：水溶液(0.05%磷酸)；流速：0.35 mL/min；进样量：1 μL；柱温：35 ℃。液相色谱梯度洗脱程序见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱程序Tab 1 Liquid chromatographic gradient elution procedure

2.2 超高效液相串联质谱法色谱条件 色谱柱：ACQUITY UPLC T3色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)；流动相A：甲醇(0.1%甲酸)；流动相B：水溶液(0.1%甲酸)；流速：0.35 mL/min；进样量：2 μL；柱温：35 ℃。液相色谱梯度洗脱程序见表2。

表2 液相色谱梯度洗脱程序Tab 2 Liquid chromatographic gradient eluent procedure

2.3 质谱条件 电喷雾离子源；正离子扫描(ESI+)；多反应监测(MRM)；离子源温度：110 ℃；脱溶剂温度：320 ℃；脱溶剂氮气流速：650 L/h；毛细管电压：2.5 kV；测试药物定性、定量离子对及对应的锥孔电压和碰撞能量见表3。

表3 定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量Tab 3 Qualitative ion pair, quantitative ion pair, cone hole voltage and collision energy

2.4 样品制备

2.4.1 阴性样品 葡萄糖作为阴性样品。

2.4.2 标准储备液的制备 精密称取卡那霉素等对照品各10 mg，加5%甲醇至25 mL容量瓶中，定容，制成400 μg/mL的溶液，作为外标储备液，-20 ℃冰箱保存。

2.4.3 超高效液相色谱法工作液的制备 精密量取储备液适量，至10 mL容量瓶中，配置成200 μg/mL的工作液，4 ℃冰箱保存，用于超高效液相色谱的标准工作液使用。

2.4.4 超高效液相色谱-串联质谱法工作液的制备 取200 μg/mL的工作液用液相串联质谱方法中的初始比例流动相适量倍比稀释10倍，得20 μg/mL的工作液。

2.4.5 标准工作液的制备 取适量卡那霉素标准工作液，用空白基质溶液稀释，制备成0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/mL标准工作液，绘制标准曲线。取浓度为2 μg/mL的卡那霉素作为UPLC-MS/MS对照品溶液。

2.4.6 阳性添加样品的制备 精密称取10 mg卡那霉素加入到阴性样品190 mg中，充分混匀，配置成的50 mg/g的阳性添加样品，每次做三份，做三批，共9份平行样，每份样品至少进样2次，取平均值。报告9个回收率测定结果并计算相对标准偏差(RSD)。

2.5 提取净化方法

2.5.1 UPLC-PDA供试品 精密称取空白样品、待测样品及阳性添加样品各100 mg，各置于50 mL容量瓶中，加入5%甲醇定容至50 mL，取滤液作为UPLC-PDA供试品溶液。

2.5.2 UPLC-PDA/MS供试品 取适量母液，用初始流动相水(0.1%甲酸)∶甲醇(0.1%甲酸)=(95∶5)稀释100倍，用滤膜(0.22 μm)滤过，取滤液作为UPLC-MS/MS供试品溶液。

2.6 方法线性考察及添加回收试验结果

2.6.1 UPLC-PDA专属性 在选定的色谱条件下，卡那霉素在2.31 min左右出峰，与未知样品的保留时间和光谱图一致。而安普霉素、新霉素、大观霉素虽然光谱图相似，但分别在2.17 min、2.05 min、2.19 min左右出峰。

图1 卡那霉素色谱图Fig 1 Kanamycin chromatogram

图2 卡那霉素光谱图Fig 2 Spectrogram of Kanamycin

图3 安普霉素色谱图Fig 3 Antramycin chromatogram

图4 安普霉素光谱图Fig 4 Spectrogram of Ampramycin

图5 新霉素色谱图Fig 5 Neomycin chromatography

图6 新霉素光谱图 Figure 6 Spectrogram of Neomycin

图7 大观霉素色谱图Fig 7 Spectinomycin chromatography

图8 大观霉素光谱图Fig 8 Spectrogram of spectinomycin

2.6.2 UPLC-MS/MS专属性 在质谱中，卡那霉素在0.54 min左右出峰，保留时间和两个定性离子对都非常一致，未知样品主成分确证为卡那霉素。阴性样品、对照品、阳性添加样品、待测未知样品的质谱图如下：见图9-图12。由于待测样品的样品均一度的问题，待测样品的含量在90～130 mg/g的范围内。

图9 卡那霉素标准品溶液特征离子质量色谱图Fig 9 Characterized ion mass chromatogram of kanamycin standard solution

图10 空白样品特征离子质量色谱图Fig 10 Characteristic ion mass chromatogram of blank sample

图11 待测样品特征离子质量色谱图Fig 11 Characteristic ion mass chromatogram of sample to be tested

图12 卡那霉素阳性添加样品特征离子质量色谱图Fig 12 Characteristic ion mass chromatogram of Kanamycin positive sample

2.6.3 标准曲线 在选定的色谱条件下，使用梯度洗脱的方法，可以有效地分离各离子对，在0.2 μg/mL～5 μg/mL的范围内标准曲线方程为Y=1577.4X+149.29，Y为卡那霉素定量离子峰面积，X(μg/mL)为卡那霉素的浓度，其相关系数R2为0.9984，线性良好，见图13。

图13 卡那霉素标准曲线图Fig 13 Standard graph of Kanamycin

2.6.4 方法的准确度和精密度 卡那霉素以外标法计算，液质分离良好，无任何干扰，0.1 μg/mL的标准品溶液，信噪比(S/N)>3，确定为方法的检测限；0.2 μg/mL的标准品溶液，信噪比(S/N)>10，确定为方法的定量限。

根据药物发生药效所需要的可能添加的浓度，检测限和定量限足以满足要求。添加浓度50 mg/g，批内批间变异系数均小于10%，阳性添加样品的回收率在90%～110%(表4)。各特征离子质量色谱图见图12。

表4 卡那霉素阳性添加回收率试验结果(n=9)Tab 4 Results of Kanamycin positive recovery rate test (n=9)

3 讨论与结论

实验接到样品后，先是进行了外观检查，样品为一种白色的粉末，在有机溶剂乙腈中溶解性比较差，在水相较多的溶剂中溶解度很好，怀疑可能是β-内酰胺类、氨基糖苷类等水溶性比较良好的药物。为了节省时间，同时打开了两台仪器设备，进行流动相的平衡等前期工作，希望检测同时进行，以最快的时间出结果。然后精密称取了适量的药物，用水相较多的溶剂进行溶解至清澈，进行适量稀释后过滤上机测试。在这种未知盲样检测中，无任何标准可以借鉴，无任何文献可以参考，完全靠平时检验工作的经验积累和对药品事件的敏感度，从接到委托样品到初步确定为卡那霉素，用时两个多小时，速度很快。

实验在初期筛选时采用超高效液相色谱法，选择了乙腈(0.05%磷酸)∶水(0.05%磷酸)进行梯度洗脱，由于前期做中药非法添加物的初步筛选工作一直使用这个流动相，有一定化合物的光谱图谱库，比如解热镇痛类药物、β-内酰胺类、氟喹诺酮类药物、氨基糖苷类药物、大环内酯类药物、氯霉素类药物、酰胺醇类药物、磺胺类药物、四环素类药物等近百种药物光谱图谱库，有着丰富的检测数据库，通过光谱图进行化合物的初步筛选，通过保留时间和光谱特征，初步推测为卡那霉素。

在质谱方法确证时，考虑到前期卡那霉素出峰较早，选择甲醇(0.1%甲酸)∶水(0.1%甲酸)进行梯度洗脱，特征离子峰形良好，无干扰，分离度和精密度良好，以外标法定量，满足检测需求。查阅文献有应用CORTECS HILIC色谱柱，ACQUITY UPLC BEH HILIC C18的相关报道[11-12]，实验用ACQUITY UPLC T3色谱柱进行尝试，虽然保留时间比较早，但满足实验检测需求，在一天内顺利完成了检测任务。

本方法建立了UPLC-PDA联合UPLC-MS/MS法测定未知药品中的卡那霉素，采用外标法，对样品进行提取稀释后测定，准确性佳、灵敏度高、检测限低。通过方法学考察，本方法完全适合本批次未知药品中的卡那霉素的确证检测。