甲苯咪唑国家对照品的研制

马秋冉，杨 星，彭文绣，于晓辉

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

甲苯咪唑是一种广谱驱虫药，可用于治疗蛔虫、蛲虫、钩虫和鞭虫的感染。甲苯咪唑在临床上主要用于水产养殖业[1]，其制剂为复方甲苯咪唑粉和甲苯咪唑溶液。目前USP和EP均有该对照品供应，但价格昂贵，购买周期长，给国内相关生产企业的研发与生产带来不便。因此，研制甲苯咪唑对照品不但可以确保《中国兽药典》2020年版有效实施，还能降低企业生产成本，提高产品质量。

根据《标准物质定值的通用原则及统计学原理》[2]，本次研制分别采用质量平衡法、容量法、溯源对照品外标法3种方法对甲苯咪唑原料的含量进行定值研究。其中质量平衡法，以有关物质结果作为纯度结果，同时测定干燥失重、炽灼残渣等关键指标进行定值；容量法作为原料药的含量测定方法已被科研工作者普遍认可，其操作简便、定值准确；采用液相色谱外标法，以USP对照品作为溯源对照品进行定值，以确保含量赋值的准确性。

1 仪器与试药

1.1 仪 器 Waters e2695 高效液相色谱仪(Empower 2 色谱工作站)；Waters 2998 二极管阵列检测器(PDA)；Waters 2489 紫外检测器(UV)；Mettler XS205 电子分析天平(精度0.01 mg)；TU-1901 紫外分光光度计；TENSOR27傅里叶红外光度计；Heratherm OMH100干燥箱；CWF 11/5 高温炉。

1.2 试 药 甲苯咪唑原料由江西博莱大药厂有限公司提供，批号为20200320；甲苯咪唑对照品系统适用性对照品(来源/批号：EP/ Batch 1.2)、甲苯咪唑对照品(来源/批号/含量：USP/R096E0/99.7%)。

2 方法与结果

2.1 性 状

2.1.1 颜色 甲苯咪唑原料为白色结晶性粉末。与《中国兽药典》2015年版(以下简称“兽药典”)中对甲苯咪唑颜色描述一致。

2.1.2 溶解度 分别考察甲苯咪唑原料在丙酮、三氯甲烷、水、甲酸、冰醋酸、乙醇中的溶解度，测定结果(表1)与兽药典中对甲苯咪唑溶解度的规定一致。

表1 甲苯咪唑原料溶解度Tab 1 The solubilty of mebendazole raw material

2.2 鉴别

2.2.1 紫外鉴别 取2.1.3项下的溶液，考察甲苯咪唑在312 nm的波长处是否有最大吸收。结果见图1，甲苯咪唑原料在312 nm的波长处有最大吸收。

图1 甲苯咪唑原料紫外吸收光谱图Fig 1 UV spectrum of mebendazole raw material

2.2.2 红外鉴别 采用溴化钾压片法进行测定，采集4000～400 cm-1波段红外光谱图，考察甲苯咪唑原料与甲苯咪唑USP对照品的红外光吸收图谱是否一致。结果见图2和图3，甲苯咪唑原料的红外光吸收图谱与USP对照品的图谱一致。

图2 USP对照品红外光吸收图谱Fig 2 IR spectrum of USP reference material

图3 甲苯咪唑原料红外光吸收图谱Fig 3 IR spectrum of mebendazole raw material

2.3 质量平衡法定值

2.3.1 有关物质 参照《欧洲药典》9.0中甲苯咪唑质量标准进行测定。

2.3.1.1 液相色谱条件 色谱柱：Waters Xbridge C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：7.5 g/L乙酸铵溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～15 min，80% A，20% B; 15～20 min，70% A，30% B; 20～25 min，40% A，60% B; 25～26 min，80% A，20% B; 26～30 min，80% A，20% B)；流速：1.2 mL/min；检测波长：250 nm；进样量：10 μL；柱温：40 ℃。

2.3.1.2 供试品溶液的制备 取甲苯咪唑原料约25 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加N,N-二甲基甲酰胺(DMF)使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.1.3 对照溶液的制备 精密量取供试品溶液1 mL，置200 mL量瓶中，加DMF稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置10 mL量瓶中，加DMF稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.1.4 系统适用性溶液的制备 取甲苯咪唑系统适用性对照品(含杂质A、B、C、D、E、F和G)5 mg溶于5 mL DMF中，摇匀，即得。

2.3.1.5 测定结果 为避免单人操作产生误差，故选用两名实验室人员分别进行独立的有关物质考察试验。精密量取系统适用性溶液、供试品溶液和对照溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。在系统适用性色谱图(图4)中，杂质A、B、C、D、E、F、G和甲苯咪唑峰与相邻色谱峰的分离度均符合要求。从色谱图(图5)测定结果看，甲苯咪唑原料有关物质包括七个已知杂质和两个未知杂质。按自身对照法以峰面积计算，甲苯咪唑原料纯度分别为：99.90%、99.90%、99.92%、99.92%，均值(n=4)为99.91%。

2.3.2 干燥失重 参照《中国兽药典》2015年版一部附录0831测定，测得甲苯咪唑原料减失重量分别为0. 13%、0.10%、0.14%、0.12%，均值(n=4)为0.12%。

图4 有关物质考察的系统适用性溶液色谱图Fig 4 Liquid chromatogram of system suitability solution in related substance test

图5 有关物质考察的供试品溶液色谱图Fig 5 Liquid chromatogram of test solution in related substance test

2.3.3 炽灼残渣 炽灼残渣反映无机杂质的量。参照《中国兽药典》2015年版一部附录0841测定，测得甲苯咪唑原料中炽灼残渣含量分别0.036%、0.020%、0.040%、0.040%，均值(n=4)为0.034%。

2.3.4 质量平衡法计算结果 采用含量=色谱纯度×(1-干燥失重含量-炽灼残渣含量)×100%计算甲苯咪唑原料中甲苯咪唑含量为99.91%×(1-0.12%-0.034%)×100%=99.76%

2.4 容量法定值 参照《中国兽药典》2015年版一部中甲苯咪唑质量标准进行测定。取本品约0.25 g，精密称定，加甲酸8 mL溶解后，加冰醋酸40 mL与醋酐5 mL，照电位滴定法(附录0702 第一法)，用高氯酸滴定液(0.1 mol/L)滴定，并将滴定结果用空白试验校正。按照含量=F×(V-V空)×T/W供×100%计算甲苯咪唑含量，其中T=29.53 mg/mL，F为高氯酸滴定液(0.1 mol/L)经标定后的浓度值。测定结果分别为99.91%、99.85%、99.93%、99.93%、99.87%，均值(n=5)为99.90%。

2.5 液相色谱外标法定值 参照USP43-NF37中甲苯咪唑质量标准进行测定。

2.5.1 液相色谱条件 色谱柱：Waters Xbridge C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流动相：7.5 g/L乙酸铵溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～15 min，80% A，20% B; 15～20 min，70% A，30% B; 20～25 min，40% A，60% B; 25～26 min，80% A，20% B; 26～30 min，80% A，20% B)；流速：1.2 mL/min；检测波长：250 nm；进样量：10 μL；柱温：40 ℃。

2.5.2 供试品溶液的制备 取甲苯咪唑原料约25 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加DMF使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，加DMF稀释至刻度，摇匀，即得。

2.5.3 对照品溶液的制备 取甲苯咪唑对照品约25 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加DMF使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，加DMF稀释至刻度，摇匀，即得。

2.5.4 杂质D储备液的制备 取杂质D 5 mg 置50 mL量瓶中，加DMF溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.5.5 系统适用性溶液的制备 取甲苯咪唑对照品约25 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加DMF溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL置25 mL量瓶中，加杂质D储备液 125 μL，加DMF稀释至刻度，摇匀，即得。

2.5.6 测定结果 精密量取系统适用性溶液、供试品溶液和对照溶液各10 μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。在系统适用性色谱图(图6)中，甲苯咪唑峰与杂质D峰的分离度为6.8，符合兽药典规定。平行制备5份供试品溶液，测定结果分别为100.14%、100.10%、99.86%、99.68%、99.72%，均值(n=5)为99.90%。

图6 高效液相色谱外标法系统使用性溶液Fig 6 Liquid chromatogram of system suitability solution in assay

3 讨 论

国家对照品的研制过程中，最重要的就是确保定值准确。《标准物质定值的通用原则及统计学原理》中列出5种定值方式，单一实验室通常采用两种或更多不同原理的独立参考方法定值。因此，本次研究采用质量平衡法、容量法、高效液相色谱法3种不同原理的定值方法测定甲苯咪唑的含量，测定结果基本一致，相互佐证，充分说明了定值的准确性。

有效期是标准物质的重要变量，也是研制中关注的重点之一[3]。目前，欧洲药品质量管理局(EDQM)、美国药典委员会(USP)和中国食品药品检定研究院(NIFDC)等机构均采用定期检测稳定性后，通过网站等方式告知客户是否稳定，能否继续使用的方式代替规定有效期。这种方式不但避免了由于有效期制定过长产生的用户测定结果偏差的情况，还能减少有效期制定过短带来的浪费现象。本次研制的甲苯咪唑对照品也不规定有效期，通过定期监测稳定性的方式来保证在售对照品的产品质量。