大蒜根系分泌物对烟草镰刀菌根腐病的控制作用

吴晓婷，赖荣泉*，米月娥，顾 钢，张 榜，王巧妮

（1.闽台作物有害生物生态防控国家重点实验室/福建农林大学植物保护学院，福州 350002；2.中国烟草总公司福建省公司，福州 350003）

烟草镰刀菌根腐病Fusariumoxysporum是由镰刀菌引起的一种主要的烟草根茎类病害，在福建省各大烟区普遍发生[1]。该病害局部发生且具有潜在危害，可单独发生，也可与烟草根茎病害（如烟草青枯病或烟草黑胫病）等混合发生，给烟叶生产带来巨大的损失[2]。镰刀菌一般存在于烟株根、茎、叶和花等部位，但根部相对较多[3]。目前烟草根腐病防治方法有：农业防治、化学防治和生物防治等。目前，在生产上仍主要依赖于化学防治，但由于化学农药长期大量使用导致病原菌抗药性增强、环境污染严重、烟叶品质下降和危害人类身体健康等一系列问题的出现，该方法已然不是一种经济、安全的防控措施[4]。而生物防治虽已取得一定的研究成果，但还未有一个具体的有效防治方法。烟草根腐病的防治仍是世界面临的一大难题，而发展一个新型抗菌剂，对烟草根腐病菌的防治具有重要的意义。

大蒜AlliumsativumL.为百合科葱属植物，种质资源丰富，我国大蒜种植面积占全球的85%以上[5,6]。在农业生产中，大蒜是公认的良好前茬作物，一些作物与大蒜轮间套可减轻病虫害的发生[7-10]。其原因可能是大蒜根系分泌物或其根系中的物质影响下茬作物[11]。前人研究表明，利用大蒜根系分泌物的抑菌作用在许多植物真菌、细菌病原物上均表现出较好的防治效果[12-14]。钏有聪等[15]报道了大蒜与烤烟轮作可有效降低烟草黑胫病的发生。大蒜粗提物对烟草青枯病和黑胫病均有不同程度的抑制作用[13,16,17]。然而，大蒜根系分泌物中的抑菌成分及其对烟草主要病害烟草镰刀菌根腐病菌的抑制活性目前未见报道。

因此，为有效控制烟草根茎病的发生，减少化学农药的使用，本课题组前期在烟田利用大蒜与其套种等来防控烟草根茎病害，取得了明显的控害效果[7,8,17,18]。在前期研究的基础上，本研究继续通过收集、鉴定大蒜根系分泌物主要成分，测定分析其主要成分对烟草镰刀菌根腐病的影响，以期为利用大蒜控制烟草主要病害或研制植物性抑菌剂提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

大蒜品种：山东紫皮蒜，孝贤故里寻味鱼台生产。

烟草品种：烤烟红花大金元，由福建省烟草农业科学研究所南平分所提供。

病原：烟草尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum由福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室提供。

试剂：99.5%邻苯二甲酸二丁酯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司；98.0% 2,6−二异丙基苯酚，上海麦克林生化科技有限公司；85.0%二烯丙基二硫，上海麦克林生化科技有限公司；AR，2,6−二叔丁基对甲酚，上海麦克林生化科技有限公司；99.5%甲醇，西陇科学股份有限公司。

PDA培养基：马铃薯浸粉5.0 g，葡萄糖20.0 g，琼脂14.0 g，pH 5.8～6.2。

仪器材料：Agilent 7890B−5977A气相色谱−质谱仪（GC−MS），美国安捷伦公司；MRC−250B−LED人工气候箱，宁波普朗特仪器有限公司；AUY120电子天平，日本岛津公司；OLYMPUS BX43生物显微镜，福建远明生物科技有限公司；MLS−3781L−PC灭菌锅，日本Panasonic公司；RE−52旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；品氏泥炭基质，丹麦品氏托普公司；塑料瓶（瓶口直径95 mm，瓶底直径80 mm，高85 mm，容积450 mL）等。

1.2 试验方法

1.2.1 大蒜根系分泌物的收集 参考周艳丽等[19]和刘素慧等[20]方法。采用固体琼脂培养法，挑选大小一致且无病斑的蒜瓣，自来水流水冲洗0.5～1 h，在无菌条件下，用75%乙醇将蒜瓣消毒1 min，经无菌水冲洗3次后，再用10%次氯酸钠消毒30 min，无菌水冲洗3次，无菌滤纸吸干蒜瓣表面水分。播入装有50 mL琼脂培养基（6‰）的塑料瓶中，每瓶 5瓣，以不种大蒜的琼脂培养基作为对照。每个处理或对照重复 3次，共6个塑料瓶，置于25 ℃室温下自然生长。30 d后拔掉大蒜，称根质量后，按1 g根质量和5 mL蒸馏水的比例加入塑料瓶中浸提琼脂，即得含有大蒜根系分泌物的培养基。

1.2.2 大蒜根系分泌物粗提物对烟草镰刀菌根腐病菌的影响测定 参考王军等[14]的菌丝生长速率法测定大蒜根系分泌物粗提物对烟草镰刀菌根腐病菌的影响。大蒜根系分泌物处理浓度为0.20、0.40、0.60、0.80和1.00 g/mL。将PDA培养基倒入直径9 cm的培养皿中，冷却凝固后，吸取2 mL不同浓度大蒜根系分泌物滴加至培养基表面，用涂布棒涂抹均匀。待分泌物浸入培养基表面后，用消过毒的5 mm打孔器在供试病原菌菌落边缘打制菌饼，再将其接种在培养基表面中央，每皿1个菌饼，每个处理3个重复，以不加大蒜根系分泌物为对照。置于温度28 ℃，相对湿度75%的人工气候箱中暗培养，5 d后利用十字交叉法测定菌落直径，抑制率（%）＝（对照菌落直径－处理菌落直径）/（对照菌落直径－菌饼直径）×100。

参考程智慧等[21]的方法，采用水琼脂孢子萌发法。将病原菌培养一段时间后，使其产孢，用含0.1%的吐温80无菌水将孢子洗脱，并稀释至其在40倍物镜下每个视野含20个孢子左右的菌悬液。大蒜根系分泌物处理浓度为0.20、0.40、0.60、0.80和1.00 g/mL，以不加大蒜根系分泌物为对照。分别吸取100 μL菌悬液，与100 μL不同浓度大蒜根系分泌物混匀。将载玻片放入铺有滤纸的培养皿中，用直径15 mm的打孔器打取水琼胶培养基（2%）置于载玻片上，用移液枪吸取混合液20 μL于水琼胶培养基上，每皿2片。置于温度28 ℃、相对湿度为75%的人工气候箱中保湿暗培养，8 h后在显微镜（40倍物镜）下观察病原菌孢子萌发情况，孢子萌发率（%）＝萌发孢子数/孢子总数×100，孢子萌发抑制率（%）＝（对照孢子萌发率－处理孢子萌发率）×100。

1.2.3 大蒜根系分泌物的分离、鉴定 参考周艳丽和程智慧[22]的方法。大蒜根系分泌物，与乙酸乙酯按1∶2体积比例萃取，经分液漏斗分离，收集乙酸乙酯层，水相再与乙酸乙酯按1∶2体积比例萃取，萃取3次，并合并3次的乙酸乙酯层，将乙酸乙酯层经无水Na2SO4干燥，用旋转蒸发仪50 ℃下减压浓缩至干，将浓缩液溶于5 mL甲醇中，并用细菌过滤器过滤浓缩液后，供GC－MS分析测试用。

参考刘素慧[20]方法测定：色谱条件为HP～5色谱柱；载气为He；50 ℃保持5 min，以5 ℃/min速度升至280 ℃，保持25 min；质谱条件：EI源；扫描的范围在30～600 amu。

1.2.4 大蒜根系分泌物主要成分对烟草尖孢镰刀菌根腐病菌的影响 参考钏有聪等[15]的方法，测定菌丝生长。选取大蒜根系分泌物主要成分邻苯二甲酸二丁酯、2,6−二叔丁基对甲酚、二烯丙基二硫和2,6−二异丙基苯酚进行试验。用甲醇将以上化合物制成浓度为20 mmol/L的母液，将母液按不同比例加入PDA培养基中，制成终浓度为0.00（CK）、0.05、0.10、0.50、1.00和5.00 mmol/L的带药平板，用消过毒的5 mm打孔器在供试病原菌菌落边缘打制菌饼，将其接种在培养基表面中央，每皿1个菌饼，每个处理3个重复。置于温度28 ℃、相对湿度为75%的人工气候箱中保湿暗培养，5 d后利用十字交叉法测定菌落直径，并计算生长抑制率。

参考程智慧等[21]的方法，采用水琼脂孢子萌发法。除用20%甲醇将邻苯二甲酸二丁酯、2,6−二叔丁基对甲酚、二烯丙基二硫和2,6−二异丙基苯酚稀释为浓度为0.00（CK）、0.05、0.10、0.50、1.00和5.00 mmol/L外，其他试验方法同1.2.2。

1.2.5 试剂对烟草尖孢镰刀菌根腐病的控制作用测定 参考杨瑞秀等[23]的伤根法接种，把事先育好的大小一致5叶1心烟苗移栽入装有基质的花盆中（外径84 mm，高72 mm），选取长势、株高等基本一致的烟草幼苗进行处理。分别选取对烟草尖孢镰刀菌菌丝和孢子有较好抑制作用的2,6−二异丙基苯酚和邻苯二甲酸二丁酯进行试验。处理浓度为0.05、0.10、0.50、1.00和5.00 mmol/L，每株浇灌20 mL的不同浓度的2,6−二异丙基苯酚和邻苯二甲酸二丁酯，每隔7 d浇1次，共浇3次。试验共5个处理和1个对照，每处理5株，重复3次，自然生长。接种尖孢镰孢菌时，用刀片在每盆烟株间靠近幼苗处划3 cm的深沟，将孢子悬浮液（1×106cfu/mL）灌入沟内，每株浇灌15 mL，以只接种尖孢镰孢菌为对照（CK）。置于温度为28 ℃、相对湿度为90%的人工气候箱中培养，每隔7 d调查、统计1次发病情况，共3次。烟草尖孢镰刀菌根腐病病害分级标准[24]：0级：全株无病状；1级：轻度维管褪色，无外部症状；2级：中度维管褪色，无外部症状；3级：下部叶片变黄，并逐渐萎蔫；4级：大部分萎蔫；5级：植株枯死。病情指数＝∑（病情指数×该级发病株数）/（总调查株数×病情最高级数）×100，防治效果（%）＝（对照病情指数－处理病情指数）×100。

1.3 数据统计与分析

文中数据统计均用Excel 2003和SPSS 22.0软件进行处理、分析。单因素方差分析（α＝0.05），文中数据均为（平均值±标准误）。

2 结果与分析

2.1 大蒜根系分泌物对尖孢镰刀菌的抑制作用

由图1和图2可知，随着大蒜根系分泌物粗提物浓度的升高，大蒜根系分泌物粗提物对烟草尖孢镰刀病菌菌丝生长的抑制率和孢子萌发抑制率逐渐增强，且抑制率间达极显著差异（F5,12＝37.377，P＝0.000；F5,12＝159.836，P＝0.000），而烟草尖孢镰刀病菌孢子萌发率逐渐下降。大蒜根系分泌物粗提物对烟草尖孢镰刀病菌孢子萌发率和孢子萌发抑制率分别为13.91%～88.87%和6.78%～100.00%，且其孢子萌发率间差异达极显著（F5,12＝312.026，P＝0.000）。

图1 大蒜根系分泌物粗提物对烟草尖孢镰刀病菌菌丝生长的影响Fig.1 Effects of crude extracts of garlic root exudates on mycelial growth of F.oxysporum

图2 大蒜根系分泌物粗提物对烟草尖孢镰刀菌孢子萌发的影响Fig.2 Effects of crude extracts of garlic root exudates on spore germination of F.oxysporum

2.2 大蒜根系分泌物的收集、分离和鉴定

由表1可知，大蒜根系分泌物为有机酸类、烷烃类、芳香族、酯类和杂环类化合物。主要有20种，按照相对含量多少依次为邻苯二甲酸二丁酯＞乙酸丁酯＞己二酸二辛酯＞间叔丁基苯酚＞对二甲苯＞苯甲酸甲酯＞4−（1,1,3,3−四甲基丁基）−苯酚＞苯甲酸，2,5−双（三甲基甲硅烷氧基），三甲基甲硅烷基酯＞苯乙烯＞1−甲基萘＞N−苄基−N−乙基−对异丙基苯甲酰胺＞N−（3−甲基苯基）−乙酰胺＞1,2−苯二甲酸双（2−甲基丙基）酯＞2,3,4−三氟苯甲酰氯＞甘菊蓝＞2,7−二甲基萘＞9,9−二甲基−9−硅芴＞6−甲基−4−吲哚醇＞邻苯二甲酸二异辛酯＞2,6－二叔丁基对甲酚等。

表1 大蒜根系分泌物的化学成分Table 1 Chemical constituents of garlic root exudates

2.3 大蒜根系分泌物主要成分对烟草尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制作用

从表2可以看出，除二烯丙基二硫在浓度为0.05 mmol/L时对菌丝生长稍有促进作用外，其他浓度下4种主要成分对烟草尖孢镰刀病菌菌丝生长均有不同的抑制作用。2,6−二异丙基苯酚和2,6−二叔丁基对甲酚对烟草尖孢镰刀病菌菌丝生长抑制率间差异均达极显著（F5,12＝65.463，P＝0.000；F5,12＝49.267，P＝0.000），且2,6−二异丙基苯酚比其他试剂的抑菌效果较好。在浓度为5.00 mmol/L时，其抑菌率达到83.45%。当浓度达到1.00 mmol/L时，二烯丙基二硫和邻苯二甲酸二丁酯对其菌丝生长抑制率间均达极显著差异（F5,12＝9.437，P＝0.001；F5,12＝26.719，P＝0.000）。因此，4种主要成分对烟草尖孢镰刀病菌菌丝生长的抑菌效果强弱顺序为 2,6−二异丙基苯酚＞邻苯二甲酸二丁酯＞2,6−二叔丁基对甲酚＞二烯丙基二硫。

表2 大蒜根系分泌物主要成分对烟草尖孢镰刀病菌菌丝生长的抑制活性Table 2 Inhibitory activity of main components of garlic root exudates on the growth of F.oxysporum

2.4 大蒜根系分泌物主要成份对烟草尖孢镰刀菌孢子萌发的影响

由表3和表4可知，4种主要成分对烟草尖孢镰刀菌孢子萌发均有不同抑制作用，且其萌发率、抑制率间均达显著性差异。除2,6−二异丙基苯酚处理外，其他处理浓度为1.00、5.00 mmol/L时，孢子萌发率为0，孢子抑制率100%。当各处理浓度达到0.50 mmol/L时，邻苯二甲酸二丁酯、2,6−二叔丁基对甲酚、二烯丙基二硫和 2,6−二异丙基苯酚对烟草尖孢镰刀菌孢子萌发率分别为 35.36%、63.79%、48.63%和87.52%，其抑制率分别为88.12%、34.68%、50.21%和10.39%。其中，邻苯二甲酸二丁酯对烟草尖孢镰刀菌孢子萌发率最小（F5,12＝1331.419，P＝0.000），其抑制率最大（F5,12＝5690.018，P＝0.000）。因此，4种主要成分对烟草尖孢镰刀菌孢子抑制效果强弱顺序为邻苯二甲酸二丁酯＞二烯丙基二硫＞2,6−二叔丁基对甲酚＞2,6−二异丙基苯酚。

表3 大蒜根系分泌物主要成分对烟草尖孢镰刀病菌孢子萌发率的影响Table 3 Effects of garlic root secretions on germination rate of F.oxysporum

表4 大蒜根系分泌物主要成分对烟草尖孢镰刀病菌孢子萌发抑制率的影响Table 4 Effects of garlic root exudates on the inhibition rate of spore germination of F.oxysporum

2.5 试剂对烟草尖孢镰刀菌根腐病的防控作用

由表5和表6可知，2,6−二异丙基苯酚和邻苯二甲酸二丁酯对烟草尖孢镰刀菌根腐病均有一定的防治效果，且其防治效果均与浓度成正比。2,6−二异丙基苯酚对烟草尖孢镰刀菌根腐病的防控效果间差异不显著，接菌7、14和21 d后，病情指数分别在50.00～60.00、51.11～64.33和60.00～72.00，与对照间差异显著（F5,12＝3.750，P＝0.028；F5,12＝4.352，P＝0.017；F5,12＝5.311，P＝0.008），防治效果分别在 20.58%～33.82%、18.45%～35.21%和 11.48%～26.23%，其防治效果间无显著差异（F5,12＝1.125，P＝0.398；F5,12＝1.268，P＝0.345；F5,12＝1.943，P＝0.180）。

表5 2,6−二异丙基苯酚对烟草尖孢镰刀菌根腐病的防控作用Table 5 Control effects of 2,6-diisopropylphenol on F.oxysporum

表6 邻苯二甲酸二丁酯对烟草尖孢镰刀菌根腐病的防控作用Table 6 Control effects of dibutyl phthalate on F.oxysporum

同一时间不同浓度，邻苯二甲酸二丁酯对烟草尖孢镰刀菌根腐病的病情指数间有不同程度的差异性。在接菌7、14和21 d后，病情指数分别在43.33～70.00、50.00～71.11和55.00～72.44，其病情指数间差异极显著（F5,12＝8.986，P＝0.001；F5,12＝5.626，P＝0.007；F5,12＝7.932，P＝0.002），其防治效果分别在7.35%～42.65%、9.86%～36.62%和10.66%～32.38%；接菌7、21 d后防治效果间差异显著，接菌14 d后其防治效果间差异不显著（F4,10＝12.753，P＝0.001；F4,10＝4.375，P＝0.027；F4,10＝3.256，P＝0.059）。在接菌7、14和21 d后，对照组的病情指数分别为75.55、78.89和81.33。总体上，邻苯二甲酸二丁酯比 2,6−二异丙基苯酚对烟草尖孢镰刀菌根腐病有一定防控效果，其控制效果在 7.35%～42.65%。

3 讨论

本研究采用固体琼脂培养法，对大蒜根系分泌物中的成分进行分析确定。经GC−MS分析表明，大蒜根系分泌物为有机酸类、烷烃类、芳香族、酯类和杂环类化合物。其主要成分有邻苯二甲酸二丁酯、乙酸丁酯、己二酸二辛酯、间叔丁基苯酚和对二甲苯等20种。这与周艳丽等[22]和吴晓婷等[25]结果类似，但不完全一致[22]。周艳丽等[22]对大蒜根系分泌物研究发现，琼脂乙酸乙酯中主要成分为2,6−二叔丁基对甲酚、二烯丙基二硫化物、2,6−二异丙基苯酚和邻苯二甲酸二丁酯4种化感物质。造成这种结果的原因可能是由于大蒜品种不同、培养条件不同等原因所致。吴晓婷等[25]研究发现用沙培法、砂土培法和水培法培养大蒜时，其主要成分均含有邻苯二甲酸二丁酯，本试验琼脂培养大蒜，其主要成分也含有邻苯二甲酸二丁酯，但其他主要成分与本试验相比均不相同，究其原因可能是由于大蒜品种、收集方法和培养条件的不同致使大蒜生理代谢出现差异，进而导致大蒜根系分泌物主要成分不同。

本研究发现大蒜根系分泌物对烟草尖孢镰刀菌菌丝和孢子萌发均具有极显著的抑制作用，特别对孢子萌发抑制效果更好，其抑制率达100.00%。这与汤东生等[26]及张潇丹等[27]报道大蒜根系分泌物对石榴枯萎病菌、枯草芽胞杆菌、镰刀菌均具有抑制作用结果相一致。大蒜根系分泌物主要成分对烟草尖孢镰刀菌菌丝生长和孢子萌发也具有显著的抑菌效果，2,6−二异丙基苯酚浓度为5 mmol/L时，对烟草尖孢镰刀菌菌丝生长的抑制率达 83.45%。以邻苯二甲酸二丁酯对烟草尖孢镰刀菌孢子萌发抑制效果较强，当其浓度高于0.5 mmol/L时，其孢子萌发抑制率在88.12%以上。其次依次为二烯丙基二硫、2,6−二叔丁基对甲酚和2,6−二异丙基苯酚。这与周宝利等[28]、关晔晴等[29]和刘海娇等[30]报道的结果相一致。周宝利等[28]报道了邻苯二甲酸二异丁酯茄子黄萎病菌菌丝有较好的抑制作用。关晔晴等[29]发现了2,6−二叔丁基对甲酚对番茄灰霉病菌、小麦赤霉病菌、番茄早疫病菌、辣椒枯萎病菌、梨黑斑病菌、小麦叶枯病菌六种病原菌均有不同程度的抑菌作用。刘海娇等[30]报道了二甲基二硫醚、二甲基三硫醚和异硫氰酸烯丙酯三七根腐病菌均有较强的抑菌效果。

本研究通过对大蒜根系分泌物的组分分析，推测大蒜根系分泌物对烟草尖孢镰刀菌根腐病菌的抑制作用可能与邻苯二甲酸二丁酯、2,6−二叔丁基对甲酚、二烯丙基二硫和2,6−二异丙基苯酚4种化感物质有关。通过功能鉴定，发现邻苯二甲酸二丁酯比2,6−二异丙基苯酚对烟草尖孢镰刀菌根腐病有更强的防控作用，其控制效果在7.35%～42.65%。这说明大蒜具有防治烟草尖孢镰刀菌根腐病中的潜在应用前景和烟田间套种大蒜对烟草主要病害防控作用。但关于大蒜根系分泌物及其主要成分对烟草尖孢镰刀菌根腐病菌的生理生化及分子机制，有待进一步研究。

致谢：本试验中烟草尖孢镰刀菌Fusariumoxysporum由福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室肖顺教授提供，该试验也得到福建农林大学应用生态研究所仪器等支持、帮助，在此表示感谢！