对紫茎泽兰具有除草活性的特基拉芽胞杆菌ZLSY5的鉴定及发酵条件筛选

兰明先，白云梅，王志江，谢永辉，朱法亮，詹莜国，曾舒泉，吴国星*

（1.云南农业大学植物保护学院，昆明 650201；2.云南省烟草公司昆明市公司，昆明 650051）

在农业领域，杂草比其他任何农业害虫都能造成更大的作物产量和质量的下降[1]。在现代农业中，农作物保护很大程度上依赖于使用合成除草剂来控制杂草[1]。除草剂是作物保护类产品的重要组成部分，广泛应用于水稻、玉米和小麦等主要作物，对提高作物质量和产量起着至关重要的作用[2]。在提倡生态文明的当下，微生物除草剂越来越多的应用于农林牧业。紫茎泽兰EupatoriumadenophorumSpreng，属菊科泽兰属，是一种入侵性极强的多年生恶性杂草，是我国外来入侵物种中危害最为严重的植物之一[3]。目前利用泽兰实蝇控制紫茎泽兰是生物防治的一个重要措施，但紫茎泽兰分蘖能力和繁殖能力较强，导致泽兰实蝇的寄生速度赶不上紫茎泽兰的扩散速度，控制效果有限[4,5]。在之前的研究中发现，从泽兰实蝇幼虫中分离纯化得到的22株共生菌中，有6株菌（分别属于芽胞杆菌属、泛菌属等）对紫茎泽兰叶片有侵害作用[6]，其中菌株ZLSY5具有一定的除草活性，但该菌株的进化关系及发酵条件尚未研究清楚。因此，通过对细菌的形态特征观察以及系统进化树的建立，鉴定了菌株的种属关系；采用两因素有重复试验，对菌株ZLSY5的基础发酵培养基和发酵条件进行了优化，明确其最佳发酵条件，为利用该菌株防治紫茎泽兰奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌种 保存于本实验室，菌株编号为ZLSY5。

1.1.2 供试培养基 营养琼脂培养基（NA）：牛肉膏 0.6 g，蛋白胨 2 g，NaCl 1 g，琼脂 3 g，蒸馏水200 mL，121 ℃ 灭菌20 min；蛋白胨酵母培养基（LB）：蛋白胨 2 g，酵母浸粉 1 g，氯化钠 2 g，琼脂 3 g，蒸馏水200 mL，121 ℃灭菌20 min；细菌基础培养基（CM）：葡萄糖 1 g，(NH4)2SO40.4 g，柠檬酸钠0.2 g，MgSO4·7H2O 0.04 g，K2HPO40.8 g，KH2PO41.2 g，琼脂 3 g，蒸馏水 200 mL，121 ℃灭菌 20 min；牛肉膏酵母葡萄糖培养基（NYBD）：牛肉浸膏1.6 g，酵母浸粉1 g，葡萄糖 2 g，琼脂 3 g，蒸馏水200 mL，115 ℃灭菌30 min；蛋白胨酵母蔗糖培养基（YSP）：蛋白胨 2 g，酵母浸粉 1 g，蔗糖 4 g，琼脂 3 g，蒸馏水200 mL，115 ℃灭菌30 min。

1.2 内共生菌的鉴定

1.2.1 内共生菌的分离 对采回的虫瘿整体消毒后在超净工作台内解剖出幼虫，将幼虫体表消毒后解剖，获得体内各组织[7]。分别收集所获得的各组织于离心管内，研磨后梯度稀释制备菌悬液。取 10-5、10-6、10-7稀释度的菌悬液0.1 mL，分别接种在NA培养基上，每个梯度做3个重复[8]。将接菌后的培养皿倒置，28 ℃培养2 d[9]。待长出单菌落后，进行纯化培养。纯化3～4次可得纯化后的单菌落[10]。

1.2.2 菌落菌体特征观察 挑取纯化后的单菌落接种于LB培养基，28 ℃培养2 d，获得单菌落。待长出单菌落后观察其形态[11]。挑取单菌落涂布于载玻片上，做单染色，革兰氏染色[12]。在显微镜下观察菌体形态，测定菌体大小，记录革兰氏染色结果。

1.2.3 16S rDNA的扩增和测序 将所纯化分离的菌做16S rDNA基因序列鉴定。根据形态特征归类的微生物类群，选用试剂盒提取代表单菌落DNA，方法根据试剂盒说明书。将提取的DNA用于细菌高变动区段V4区的体外扩增，引物为16S V4区通用引物[13]。PCR产物回收纯化使用pJET载体链接，通过BJIⅡ 酶切鉴定并送生物公司测序（昆明擎科生物公司），测序结果在GenBank（http://www.ncbi.nih.gov）中进行BLAST 比对分析。

1.2.4 系统发育树的构建 测序结果通过 DNAstar和chromas 软件校对，并在NCBI中blast比对下载已发表的最高相似序列，相关序列用MEGA 6.0软件经CLUSTALW比对，采用 Jukes-cantor模型构建N-J树[7]。

1.3 内共生菌发酵条件筛选

1.3.1 培养基对细菌菌液浓度的影响 挑取纯化后的ZLSY5单菌落接种于LB液体培养基，28 ℃摇床180 r/min培养16 h，OD值为0.8～1.2，获得菌悬液。取50 μL ZLSY5的菌悬液分别接种于100 mL的YSP、NA、NYBD、CM和 LB培养基中。在25 ℃，220 r/min的摇床里振荡培养24、48和72 h，采用分光光度法测定菌液在600 nm处的OD值，从而测定菌液浓度[14]。

1.3.2 氮源对细菌菌液浓度的影响 以上述试验筛选出的培养基为基础培养基，用基础培养基为对照，试验组分别加入酵母膏（JMG）、甘氨酸（Gly）、蛋白胨（DBD）、硝酸铵（XSA）、丙氨酸（Ala）和谷氨酸（Glu）作氮源，发酵培养24、48和72 h后分别测定不同氮源培养基的OD值，以此明确氮源对细菌菌液浓度的影响[14]。

1.3.3 碳源对细菌菌液浓度的影响 将1.3.1中筛选出的适合ZLSY5生长的培养基作为基础培养基，以碳源为蔗糖时作为对照，葡萄糖（PPT）、蔗糖（ZT）、麦芽糖（MYT）、乳糖（RT）、淀粉（DF）作碳源，发酵培养24 h后测定第1次OD值，48 h后测第2次，72 h后测第3次，与对照比较不同碳源对细菌菌液浓度的影响[14]。

1.3.4 pH 对细菌菌液浓度的影响 制备优化的培养基，调节pH分别为 4、5、6、7、8、9、10，将50 μL菌株ZLSY5菌悬液接种于不同pH的培养基中，放于摇床培养24、48、72 h后测定菌株在不同pH条件下的OD值，以此来判断pH对细菌菌液浓度的影响[15]。

1.3.5 温度对细菌菌液浓度的影响 在优化培养基中接种50 μL的菌株ZLSY5菌悬液，在温度16 ℃、20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃和40 ℃，转速为220 r/min的摇床中培养24、48、72 h后，测定各温度下的OD值，从而判断温度对细菌菌液浓度的影响[15]。

1.3.6 转速对细菌菌液浓度的影响 将菌株接种到优化培养基中，培养条件采用上述优化条件，设定摇床转速分别为140、160、180、200、220、240 r/min，测定不同转速下菌液的OD值[15]。

1.3.7 光照对细菌菌液浓度的影响 采用优化培养基配方，培养条件采用上述优化条件，设定光照为0 h/d、4 h/d、8 h/d、12 h/d、16 h/d、20 h/d、24 h/d，测定不同光照对细菌菌液浓度的影响。

1.3.8 通气量对细菌菌液浓度的影响 在250 mL的三角瓶中分别加入优化发酵培养基20、40、80、120和160 mL，在220 r/min的摇床培养，测定不同通气量下细菌的OD值[15]。

1.3.9 初始接菌量对细菌菌液浓度的影响 将菌株ZLSY5菌悬液按100 mL装液量的0.5%、1%、5%、10%、20%、25%和30%分别接入到优化培养基中，测定在不同接菌量条件下细菌OD值，从而判断初始接菌量对细菌的菌液浓度有何影响[16]。

1.3.10 发酵时间对细菌菌液浓度的影响 采用优化培养基，培养条件采用上述优化的温度、pH、初始接菌量、通气量，分别发酵12、24、36、48、60、72、96、108、120、132和144 h，测定不同发酵时间对ZLSY5菌液浓度的影响[14]。

1.4 除草活性比较

菌株ZLSY5对紫茎泽兰叶片影响作用的测定采用叶圆片法。选取紫茎泽兰植株固定部位大小一致的叶片，在清水里冲洗一段时间，取出叶片晾干，用30%过氧化氢对叶表面灭菌。将灭菌后的滤纸平铺于无菌培养皿内，试验组加入5 mL于摇床培养24 h的菌悬液，对照组加入5 mL的无菌水。设13个对照和12个处理。对照分别为无菌水对照、LB液体培养基的原液、2倍、4倍、8倍、16倍和32倍稀释液，NYBD液体培养基的原液、2倍、4倍、8倍、16倍和32倍稀释液，处理分别为LB培养基细菌发酵液原液、2倍、4倍、8倍、16倍和32倍稀释液，NYBD培养基细菌发酵液原液、2倍、4倍、8倍、16倍和32倍稀释液。用直径为6 mm的打孔器打取紫茎泽兰叶圆片，叶背面向上平放于放有滤纸的5 mL菌悬液的培养皿内，用保鲜膜封口后置于（25±2）℃，光周期 12L∶12D的培养箱条件下培养，3次重复，每隔24 h统计一次结果。采用分级统计方法记录紫茎泽兰叶圆片的受害情况。评价菌悬液对叶圆片侵害程度的标准如表 1[6]。侵害指数＝Σ（该级别值×出现该级别的圆片数）/（5×所有观察的圆片数）×100%。

表1 评价菌株ZLSY5菌悬液对紫茎泽兰叶圆片侵害程度的标准Table 1 The standard of the violation severity of E.adenophorum leaf discs caused by the bacteria suspension of strain ZLSY5

1.5 数据统计与分析

用SPSS 16.0软件进行数据处理与分析；Duncan氏新复极差法检验。

2 结果与分析

2.1 内共生菌鉴定结果

菌落直径3～4 mm，表面粗糙，不透明，褶皱，卡其色，拱起状，边缘整齐。菌体杆状，1.5～2.53 μm。芽胞椭圆形，（0.7～1.06）μm×（1.25～1.9）μm，革兰氏阳性菌。由进化树可得菌株ZLSY5为特基拉芽胞杆菌Bacillustequilensis10b（图1）。

图1 菌株ZLSY5 N-J进化树Fig.1 N-J evolutionary tree of strain ZLSY5

2.2 发酵条件筛选

2.2.1 培养基优化结果 菌株ZLSY5在不同培养基上的菌液浓度在各个时间段内均有显著差异（F＝77307.835，df＝8，P＝0.0001）。在24～72 h，菌株ZLSY5在NYBD培养基上菌液浓度呈稳定趋势上升，72 h后菌液浓度高达2.236。从整体上看，细菌在NYBD培养基上生长最快，YSP培养基在48 h后菌液浓度增长趋势减缓（图2）。

图2 培养基对菌株ZLSY5生长速度的影响Fig.2 Effect of medium on the growth rate of strain ZLSY5

2.2.2 氮源筛选结果 菌株ZLSY5在各个时间段内不同氮源对ZLSY5菌液浓度的影响有显著差异（F＝1085.185，df＝10，P＝0.0001）。酵母膏作氮源时最适合菌株ZLSY5生长，其次为蛋白胨，而甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸和硝酸铵不适合作菌株ZLSY5的氮源（图3）。

图3 氮源对菌株ZLSY5生长速度的影响Fig.3 Effect of nitrogen source on the growth rate of strain ZLSY5

2.2.3 碳源筛选结果 菌株ZLSY5在葡萄糖（PPT）、蔗糖（ZT）、麦芽糖（MYT）和乳糖（RT）、淀粉（DF）等碳源上均能生长。而且在各个时间段内，5种碳源对菌株 ZLSY5的生长均有显著影响（F＝70269.76，df＝8，P＝0.0001）。这5种碳源均可作为菌株ZLSY5的碳源来利用，相较而言，葡萄糖、麦芽糖和蔗糖作为碳源要优于淀粉和乳糖（图4）。

图4 碳源对菌株ZLSY5生长速度的影响Fig.4 Effects of carbon source on the growth rate of strain ZLSY5

2.2.4 pH优化结果 菌株 ZLSY5在各个时间段内不同 pH对 ZLSY5菌液浓度的影响有显著差异（F＝164.521，df＝12，P＝0.0001）。pH 4～10时，菌株ZLSY5的菌液浓度没有随着时间增加而增加，而pH在5～9时，在24～48 h内菌液浓度均随着时间的增加而不断增大，表明在pH 5～9范围内菌株ZLSY5均可生长（图5）。

图5 pH对菌株ZLSY5生长速度的影响Fig.5 Effect of pH on the growth rate of strain ZLSY5

2.2.5 温度筛选结果 菌株ZLSY5在各个时间段内不同温度对ZLSY5菌液浓度的影响有显著差异（F＝41.305，df＝12，P＝0.0001）。在72 h时，除40 ℃以外，各温度下菌液浓度有差异，但是差异较小。由此表明，菌株ZLSY5在温度16 ℃～36 ℃均能生长，而最适合其生长的温度是28 ℃（图6）。

图6 温度对菌株ZLSY5生长速度的影响Fig.6 The influence of temperature on the growth rate of strain ZLSY5

2.2.6 转速筛选结果 不同的转速下 ZLSY5菌液浓度有显著的差异（F＝7.274，df＝10，P＝0.0001）。不同转速下测得的OD值结果显示，当转速为200、220和240 r/min时，菌株ZLSY5的菌液浓度增长较快。转速为240 r/min时，菌株ZLSY5生长速度最快（图7）。

图7 转速对菌株ZLSY5生长的影响Fig.7 The influence of rotating speed on the growth of the strain ZLSY5

2.2.7 光照筛选结果 不同的光照时间下菌株 ZLSY5菌液浓度有显著的差异（F＝5.847，df＝12，P＝0.0001）。当光照时间为20 h/d时，菌株ZLSY5的菌液浓度最大。光照时间为0 h/d时菌液浓度最小，且菌液增长速度最小（图8）。

图8 光照时间对菌株ZLSY5生长的影响Fig.8 The influence of lighting time on the growth of the strain ZLSY5

2.2.8 通气量筛选结果 不同的通气量下ZLSY5菌液浓度有显著的差异（F＝12.357，df＝8，P＝0.0001）。当摇瓶中所装培养液为40 mL时细菌生长最快，培养24 h后基本趋于稳定，其次是20和80 mL。装液量为160 mL时细菌产生量较少（图9）。

图9 通气量对菌株ZLSY5生长的影响Fig.9 The influence ventilation quantity on the growth of the strain ZLSY5

2.2.9 初始接菌量筛选结果 不同的初始接菌量下菌液浓度有显著的差异（F＝16.611，df＝12，P＝0.0001）。当接菌量为2.00%时菌液浓度增长最快，细菌产生量最多，OD值为1.908，其次是2.50%和0.10%。在24 h时，菌液浓度受到初始接菌量的影响，但是随着培养时间的增加，初始接菌量的影响越来越小（图10）。

图10 初始接菌量对菌株ZLSY5生长的影响Fig.10 The influence of initial inoculation quantity on the growth of the strain ZLSY5

2.2.10 发酵时间对细菌菌液浓度的影响 在4 h之前，菌液浓度基本没有增长，此时处于细菌生长的迟缓期；在4 h之后，ZLSY5随着培养时间的增加其菌液浓度也随之增加，在36 h时达到最大值，此阶段是菌株的对数生长期；在36～60 h，菌液浓度处于一个较为平稳的OD值内，此时是细菌生长的平稳期；在60 h之后，随着培养时间的增加，菌株的OD值开始缓慢下降，此时处于细菌生长的衰亡期（图11）。

图11 菌株ZLSY5的生长曲线图Fig.11 The growth curve of strain ZLSY5

2.3 优化培养基后菌株ZLSY5除草活性比较

优化后的培养基NYBD培养的菌株ZLSY5对叶片的侵害效果更好。由于所得数据是消除培养基对叶片的影响后的数据，而LB培养基在原浓度和稀释2倍浓度下对叶片有侵害作用，因此在这两个浓度下LB培养基对叶片的侵害作用不明显。而优化后的NYBD培养基培养的菌株ZLSY5对叶片的影响较小，消除后随着浓度的减小，侵害作用也在相应地减小，但作用均好于LB培养基所培养的菌的侵害作用。优化后在原浓度即浓度为1时，侵害作用最大，接近90%（图12）。

图12 菌株ZLSY5优化后对紫茎泽兰叶片的侵害程度Fig.12 The degree of damage to the leaves of E.adenophorum after strain ZLSY5 optimization

3 讨论

芽胞杆菌属的细菌在分类上存在着不同的分类法。传统的芽胞杆菌分类主要依据其形态学特征，现在则大多采用多相分类法，即将形态、生理生化、化学（脂肪酸分析）、分子（DNA 碱基分析、DNA 同源性分析，16S rRNA 测序）等分类方法相结合，并根据所得数据进行聚类分析，得出的结果相对比较准确。利用分子技术可以根据菌的基因进行鉴定，将芽胞杆菌的分类地位划分的更确切。多相分类是传统的表型分类、数值分类和分子分类等方法的综合应用，因而可以更客观地反映生物间的系统进化关系[17]。

影响微生物发酵的因子有很多，主要包括碳源、氮源、温度、初始pH值等，但不同的微生物对碳源、氮源、温度等条件的选择又有差异[18,19]。从本试验研究结果来看，各个碳源对菌株 ZLSY5生长速度的影响是有差异的，但是均能生长，说明菌株 ZLSY5的发酵培养基对碳源的选择范围较广，其中对麦芽糖、蔗糖和葡萄糖利用效果较好。对于筛选最佳氮源，发现蛋白胨、酵母膏有利于菌体生长；而铵态氮源硝酸铵难以被利用，且铵态氮作氮源时在一定程度上抑制了菌株 ZLSY5的生长；用氨基酸类作为氮源，菌株的菌液浓度较低，说明氨基酸类也不适合作为氮源。

目前，大部分细菌通常用LB培养，因为在LB上生长的细菌类群相对单一，有单一类群优势或抑制其他类群生长的现象[20,21]。但本试验分别采用YSP、NB、NYBD、CM和LB培养基对菌株ZLSY5进行摇床培养，发现该菌在24 h内在NYBD生长最好，其次才是LB。与侯佳佳等[22]研究报道凝结芽胞杆菌高产活菌的最佳培养基和秦艳等[23]优化的枯草芽胞杆菌的培养基不同。可能是不同菌株适合不同的营养物质，这可能与不同菌株的遗传特征和生理特性不同有关，也与所获取菌株的特定生境有关。

在发酵条件筛选方面，培养基的初始pH直接影响菌体细胞膜所带的电荷，影响其对营养物质的吸收，进而影响细菌的生长和繁殖[23]。选择最适合的初始pH有利于菌体的生长繁殖与生物量的提高。菌株ZLSY5最适pH为5～9，说明其适合弱酸性至弱碱性的环境，过酸或者过碱都不适合生长。在一定温度范围内，随着温度的升高，细胞中蛋白质和酶活性增强，使其生长和繁殖速率大大提高；如温度过高，细菌细胞中对温度敏感的组成成分（蛋白质、核酸）会受到不可逆的破坏，抑制菌体生长和繁殖[24]。该菌在温度为16 ℃～36 ℃内均能正常生长，说明其对环境温度的适应能力较强，但在24 ℃以下生长很慢，则表明低温不适合用于该菌的发酵培养。而转速和通气量都与培养液中的氧气溶解量有关，试验结果表明装液量为40 mL/250 mL、转速为240 r/min时菌株ZLSY5的菌液浓度最大；针对接菌量的研究，则与细菌的养分利用和生长空间有关，接种量为2.0%时，细菌生长得最好，菌株ZLSY5能充分利用养分和空间，接菌量过多则因养分和空间有限，细菌生长会受到抑制。光照时长对菌株ZLSY5生长的影响表现为光照20 h/d最适其生长，说明该菌为感光型细菌。

本试验对菌株 ZLSY5的发酵条件进行优化并确定了最佳条件，提高其发酵产量，有望从中分离得到有益的活性物质，这为利用细菌防治紫茎泽兰奠定了一定的基础。但对于发酵液的活性成分尚未清楚，后续会对菌株的除草活性成分进行研究。