蛋白质泛素化介导的植物低温胁迫反应

乌凤章 王贺新

（大连大学现代农业研究院，大连 116622）

低温影响植物生长发育，限制植物地理分布，降低作物产量。因此，为了维持农业生产，了解植物低温度胁迫反应的机制是很重要的［1］。低温胁迫可分为冷胁迫（0-15℃）和冰冻胁迫（<0℃）［2］。冷胁迫使膜硬化，破坏蛋白质复合物，损害光合结构，而冰冻胁迫会对植物造成更严重的损伤。冰冻温度促进植物组织原生质体（细胞间空间）中冰晶的形 成。细胞间冰晶的积累在物理上破坏了细胞膜，导致细胞外水势下降及严重的细胞脱水［3-4］。低温锻炼是温带植物暴露于低温但非冰冻温度下获得抗冻性的过程。如温带树木、冬小麦（Triticum aestivum L.）、黑麦（Secalece reale L.）等已经进化出复杂的低温锻炼机制，从而提高其抗冻性［5-6］。

在低温胁迫下，植物通过Ca2+内流通道等感受器感知低温信号［7］，引起胞质游离Ca2+的迅速上升，随后通过磷酸化和转录级联转导，导致植物转录组的大量重新编程。因此，发生了一系列的细胞调整，如光合保护机制、保护细胞膜和其他细胞结构免受冷诱导的活性氧和脱水的影响等［8］。许多蛋白质已被确定为低温胁迫反应的重要调节因子或功能因子［9］。低温胁迫反应非常复杂，在所有层面都受到严格的调控，即转录、转录后、翻译和翻译后水平［10］。目前，关于低温胁迫反应在转录和转录后水平调控已有报道，但有关这种反应的翻译和翻译后调控的数据相当缺乏。本文回顾和讨论了有关调节植物低温胁迫反应的泛素化修饰的分子机制，尤其是泛素连接酶（ubiquitin-ligase enzymes，E3）参与植物低温胁迫反应的调节机制。

1 泛素化体系

泛素化体系包括泛素、泛素激活酶（ubiquitinactivating enzyme，E1）、泛 素 结 合 酶（ubiquitinconjugating enzymes，E2）、E3、完整的26S蛋白酶体。泛素化修饰是一种蛋白质翻译后修饰，参与蛋白酶体降解、细胞周期进展、转录调控、DNA修复和信号转导等细胞过程。

1.1 泛素

泛素是由76个氨基酸组成的多肽，通过共价键与靶蛋白的赖氨酸残基连接，这一过程称为泛素化。泛素化影响靶蛋白活性、丰度、运输或定位。在一系列酶的催化下，单个泛素分子以其C-末端赖氨酸与靶蛋白的1个赖氨酸侧链相连实现单泛素化，或与多个赖氨酸残基相连实现多泛素化，然后，其他泛素分子的赖氨酸与先前结合泛素分子的赖氨酸残基连接，实现多聚泛素化。由于泛素分子可以与上一个泛素分子的7个赖氨酸的任意一个连接，多聚泛素链能够形成不同的拓扑结构，包括K6、K11、K27、K29、K33、K48和K63位连接的泛素链形式［11］。结合在底物蛋白上的泛素链形式一定程度上决定了被修饰蛋白的命运。例如，K63位连接的泛素链修饰和单泛素化修饰可能参与DNA修复和细胞内吞作用［12］，与48位连接的多聚泛素链是降解修饰蛋白的信号［13］。

1.2 泛素化相关酶

泛素化体系包含的3个主要的酶在泛素化过程中依次行使它们的功能。E1激活泛素分子，并把激活的泛素连接到E2上。E3直接或间接地把泛素从E2转移到底物蛋白的赖氨酸残基上。此外，半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸等残基也可被泛素修饰［14］。26S蛋白酶体识别泛素化的蛋白，由去泛素化酶（deubiquitinating enzymes，DUBs）将泛素链从底物蛋白上移除并供循环利用，去泛素化的蛋白进一步被26S蛋白酶体中的蛋白酶降解［15］。不同物种的E1数量不同，小麦中至少有3种，拟南芥中至少有2种。在拟南芥蛋白质组中检测到至少37个E2，然而，植物E2的具体功能尚不清楚。在拟南芥基因组中有1 400多个基因编码E3。重要的是，E3决定蛋白质泛素化的特异性，它以时间和空间调节的方式特异性地识别和结合底物，不仅有助于细胞蛋白质组的可塑性，而且还能调节植物对低温等环境信号的反应［16］。

根据存在的特征结构域和泛素转移到底物蛋白的机制将E3分为3种主要类型，即同源E6.-AP相关蛋白质羧基末端（homologous to the E6-AP carboxyl terminus，HECT）、真正有趣的新基因（really interesting new gene，RING）和RING之间指状蛋白质（RING-between RING-RING，RBR）类 型E3或E3复合体［17］。

HECT类型E3的C端包含一个由350个氨基酸组成的保守结构域，称为HECT结构域。HECT结构域N端与泛素化的E2相互作用，C端含有催化作用的半胱氨酸，以双叶形结构为特征。2个叶由1个灵活的铰链连接，便于在泛素转移过程中叶的相对方向发生变化。HECT类型E3先将泛素转移到E3起催化作用的半胱氨酸上，然后从E3转移到底物。底物特异性由HECT E3的N端决定。

RING类型E3又分为单亚基E3和多亚基E3复合体。单亚基类型包括含有RING和含有U-box结构域的RING型E3。多亚基组的Cullin-RING泛素连接酶（Cullin-RING ubiquitin ligases，CRLs）包括4个亚家族：S期激酶相关蛋白1-淘汰素-F盒（S phase kinase-associated protein1-Cullin 1-F-box，SCF）、含Bric-a-brac、Tramtrack及Broad 复 合 体结构域蛋白（Bric-a-brac-tramtrack-broad complex，BTB）、DNA损 伤 结 合 蛋 白（DNA damage-binding domain-containing，DDB）和后期促进复合物（anaphase-promoting complex，APC）。

RING类型E3含有结合2个锌离子的RING结构域，负责结合泛素化的E2和刺激泛素转移。RING类型E3作为支架，使装载泛素的E2靶向底物蛋白，介导泛素直接转移到底物。已知水稻和拟南芥分别含有至少425个和477个RING结构域蛋白。

U-box型E3酶具有保守的约70个氨基酸U-box基序。二级结构预测表明，U-box是一个修饰的RING指结构域，缺乏典型环结构域中保守的支架、锌螯合半胱氨酸和组氨酸残基，利用氢键和盐桥来稳定这个部位构象，使得U-box结构比RING-finger更保守和稳定。在拟南芥中，约有64个U-box型E3基因已经被鉴定。这些U-box蛋白除与热休克蛋白70 C末端相互作用蛋白（carboxyl terminus of hsc70-interacting protein，CHIP）外，分别用序列号被系统地命名为植物U-box蛋白（plant U-box，PUB）。研究表明不同植物物种PUB参与许多非生物胁迫反应。与HECT类型E3连接酶不同，RING类型E3和U-box类型E3直接介导泛素从E2-Ub转移到目标蛋白上。

一些RING类型E3由多个亚基组成，如CRLs E3。CRLs E3是一类高度多样化的泛素连接酶，它们组装在Cullin支架上，在N端结合RING蛋白，用于招募E2，在C端结合适配器蛋白和底物受体（负责底物特异性）［18］。CRLs E3可进一步分为SCF、BTB、DDB 3种亚型。SCF亚型E3由（Arabidopsis SKP1-like proteins，ASK1）、CUL1/2（Cullin1/2）、RBX1（RING-Box 1）和FBX（F-box）蛋白组成，以ASK1作为适配器，F-box作为底物受体。FBX蛋白决定底物特异性。BTB亚型E3连接酶由Cul3（Cullin3）、Rbx1和BTB（含BTB结构域）蛋白组成。其中，BTB蛋白具有底物特异性。DDB亚型E3连接酶由CUL4（Cullin 4）、RBX1、DDB1（DNA damage-binding 1） 和DWD（WD40 domaincontaining protein）组成。CRL4利用DDB1作为适配器，DWD/DCAF作为底物受体组装成E3复合物，DWD蛋白负责底物的特异性识别［16］。在拟南芥蛋白质组中大约有82个DWD蛋白。DDB1与不同的DWDs相互作用的能力对于这些E3复合物的不同功能是必不可少的［19］。另一个重要的多亚基E3是后期促进复合物/细胞周期体（anaphase-promoting complex/cyclosome，APC/C），它由19个亚基组成，包括一个RING亚基（APC11）和一个类似Cullin的亚基（APC2）。

RBR类型E3由2个RING结构域（RING1和RING2）以及中间半胱氨酸富集区（in-between-RING，IBR）结构域组成。RBR类型E3的RING1负责招募泛素分子连接的E2中间体，而含有活性半胱氨酸的RING2结合泛素分子并将其转移给底物。RBR类型E3包含特定的其他结构域，其中一些结构域参与分子内相互作用，使蛋白质处于自抑制状态。自抑制通过磷酸化或蛋白质-蛋白质相互作用等机制而被解除［17］。

1.3 26S蛋白酶体

26S蛋白酶体是分布在细胞质与细胞核中的蛋白酶复合体，由20S核心颗粒（core protease，CP）和19S调节颗粒（regulatory particle，RP）组成。CP呈明显中空的圆柱形状，由4个堆积环装配而成，每个环含有7个多肽，它以不依赖于ATP和泛素的方式行使蛋白水解酶功能，将底物蛋白降解成小肽或游离的氨基酸。RP结合到CP两端，形成26S蛋白酶体，它依赖于ATP水解提供的能量，将已结合泛素的目标蛋白递送到蛋白酶体进行降解［20］。

2 蛋白质泛素化介导的低温胁迫反应

2.1 蛋白质泛素化介导的CBF依赖型低温信号转导途径

脱水响应元件结合因子（dehydration-responsiveelement-binding1，DREB1）/胞嘧啶重复结合因子（C-repeat binding factor，CBF）转录因子在植物低温胁迫响应中起着关键调控作用。通过结合冷调节（cold regulated，COR）、低温诱导（low-temperature induced，LTI）、脱水蛋白（dehydrin，DHN）以及脱水响应（responsive to dehydration，RD）基因启动子区域的DRE/CRT顺式作用元件，激活这些基因表达，提高植物抗冻性。有10%-15%的COR基因受到CBFs的调控［21］。拟南芥CBF表达的诱导物1（inducer of CBF expression 1，ICE1）为bHLH转录因子，能与CBFs启动子区域的E-Box特异地结合而激活CBFs，从而调控下游目标基因的表达，提高植株抗冻性。ICE1蛋白的转录激活作用受到蛋白质翻译后修饰的严谨调控。拟南芥中RING类型E3渗透响应高表达基因1（high expression of osmotically responsive gene 1，HOS1）与ICE1相互作用并使之泛素化。HOS1过表达降低了拟南芥对寒冷气候的忍耐能力［22］（表1和图1）。ICE1中S403被丙氨酸取代的重组ICE1与野生型蛋白相比，冷处理后积聚更多的ICE1蛋白，诱导更多的CBF和COR表达。此外，在重组ICE1蛋白中多聚泛素化被中断［23］。由此推断ICE1的丝氨酸403是控制HOS1介导的ICE1降解的关键残基之一。有趣的是，植物中的ICE1稳定性以HOS1依赖的方式响应低温而降低［22］。因此，可以认为HOS1参与了拟南芥低温胁迫反应的负反馈调节，在低温反应开始后介导了ICE1的降解。

图1 蛋白质泛素化修饰调节CBF依赖的低温信号途径 Fig. 1 Protein ubiquitination regulates the CBF-dependent low temperature signaling pathway

表1 参与植物低温胁迫反应的E3连接酶的一般性功能描述Table 1 General functional descriptions of the E3 ligases involved low temperature stress responses in plant

气孔开放因子（open stomata 1，OST1）是一种丝氨酸/苏氨酸R蛋白激酶，其突变体导致CBF转录因子的激活缺陷，从而降低了抗冻性。过表达OST1则诱导CBF转录因子积聚从而提高抗冻能力。OST1介导的ICE1磷酸化，抑制HOS1和ICE1的相互作用［24-25］，因而维持ICE1蛋白稳定性，提高ICE1转录活性，从而激活ICE1-CBF-COR低温信号通路［24］。在冷处理时，含SAP和myc基因相互作用锌指蛋白1结构域连接酶（SAP and MIZ1，SIZ1）能够介导ICE1发生SUMO化修饰。SUMO化的ICE1降低了与HOS1相互作用的能力，减弱了ICE1泛素化程度［26］。因此SIZ1是ICE1的正向调节因子，在低温信号的早期起着稳定ICE1蛋白的作用，也就是说SIZ1依赖的ICE1 SUMO化阻止其蛋白酶体介导的降解，并使CBF依赖的低温锻炼成为可能。此外，在持续低温胁迫下，蛋白激酶油菜素内酯非敏感基因2（brassinosteroid insensitive2，BIN2）的活性逐渐升高，与ICE1相互作用并使其磷酸化，促进ICE1与HOS1的相互作用，从而促进ICE1降解［27］。

研究表明，CBF蛋白也可以通过泛素介导的蛋白酶体途径降解［28］，但导致其泛素化并随后降解的E3连接酶尚未被鉴定。在寒冷胁迫下，冷响应蛋白激酶（cold-responsive protein kinase1，CRPK1）磷酸化14-3-3蛋白并触发其从细胞质转位至细胞核。在细胞核14-3-3蛋白与CBF1/3蛋白相互作用并使其失稳，从而减弱CBF途径，防止过度发生寒冷胁迫反应［28］。

通过对E3 T-DNA插入突变体库的筛选发现，U-box E3 PUB25/26参与植物低温胁迫反应。双突变体pub25 pub26中，CBFs受冷诱导水平明显低于野生型，植株表现出冰冻敏感表型。进一步研究发现，PUB25/26与冷胁迫信号负调节因子MYB15相互作用，并参与在低温处理早期MYB15的降解过程，从而提高植物抗冻性。同时，确定了PUB25/26的T95/T94位点是蛋白激酶OST1的作用位点。低温激活OST1激酶活性，激活的OST1磷酸化PUB25/26，增强PUB25/26的E3活性，促进其对MYB15蛋白的泛素化降解，从而正调控低温下CBFs的诱导表达和植物抗冻性［29］。

光敏色素相互作用因子（phytochrome-interacting factor 3，PIF3）是抑制光形态发生的关键转录因子，它在介导植物对各种环境信号的反应中起着关键作用。PIF3通过直接与CBF基因的启动子结合来下调其表达，作为拟南芥抗冻性的负调节因子。EIN3结合F结构域蛋白（EIN3-binding f-box 1，EBF1）和EBF2（EIN3-binding f-box 2，EBF2）直接靶向PIF3进行26S蛋白酶体介导的降解。与野生型相比，ebf1和ebf2突变体对冷冻胁迫更敏感，pif3突变抑制了ebf1的冰冻敏感性表型。此外，寒冷处理促进了EBF1和EBF2的降解，提高了PIF3蛋白的稳定性，从而降低了CBF基因的表达水平［30］。

An等［31］研究表明苹果MYB30相互作用连 接 酶（MYB30-INTERACTING E3 LIGASE 1，MdMIEL1）与转录因子MdMYB308L互作，促进MdMYB308L的泛素化降解，从而负调控苹果的抗寒性和花色苷积累。MdMYB308L在转录水平和转录后水平上响应低温处理，正调控低温胁迫反应和花色苷合成。MdMYB308L通过与MdbHLH33直接互作，增强MdbHLH33对MdCBF2和MdDFR的转录活性，进而提高植物低温胁迫抗性和花色苷积累水平［31］。

与拟南芥HOS1的作用相似，香蕉RING类型E3 MaSINA1与转录因子MaICE1相互作用并使之泛素化，导致MaICE1的降解和其转录活性的衰减，负调控香蕉果实的冷胁迫反应［32］。

2.2 蛋白质泛素化介导的CBF非依赖型低温信号转导途径

HY5是拟南芥中的BZIP转录因子，它调节包括光形态发生、激素反应和抗冻性等关键过程［33-34］。HY5的表达受不依赖于CBF和ABA途径的低温诱导。低温引起CRLs E3 中CUL4-DDB1亚类COP1的核耗竭而稳定HY5蛋白，从而诱导花色苷合成，抑制ROS积累，在低温胁迫反应中起作用［34］。

3 蛋白质泛素化介导激素信号通路调控低温胁迫反应

3.1 蛋白质泛素化介导乙烯合成和信号转导途径调控植物抗冻性

低温胁迫会改变植物许多物种的内源乙烯水平。增强的乙烯水平和抗冻性之间存在关联［35-36］。乙烯正影响番茄（Solanum lycopersicum cv Lichun）和烟草（Nicotiana tabacum cv NC89）的抗冻性［37-38］。 用乙烯生物合成抑制剂2-氨基乙氧基甘氨酸（Aminoethoxy vinyl glycine，AVG）处理蒺藜苜蓿A17（Medicago truncatula cv Jemalong A17）［36］、狗牙根属（Cynodon spp.）植物［39］和拟南芥［40］，提高了它们的抗冻能力，表明乙烯负影响这几种植物抗冻性。可见，乙烯对植物抗冻性的影响可能与物种对寒冷的敏感性和受胁迫时植物发育阶段有关。此外，也有研究表明乙烯前体1-氨基环丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylic，ACC）的应用提高了在土壤中生长的拟南芥幼苗抗冻性［35］，而乙烯对在装有MS培养基的培养皿中生长的拟南芥幼苗抗冻性具有负影响［40］。两种试验条件下结果的差异可能与环境相对湿度有关。Janowiak等［41］认为在相对湿度较高的环境下，乙烯对植物抗冻性具有负影响。

3.1.1 蛋白质泛素化介导乙烯的生物合成 乙烯生物合成途径首先是由甲硫氨酸（methionine，Met）合成S-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosylmethionine，SAM），SAM在ACC合成酶（ACC synthase，ACS）的作用下合成ACC，这是乙烯合成的重要限速步骤，最后ACC在ACC氧化酶（ACC oxidase，ACO）作用下生成乙烯［42］。乙烯过量表达突变体（ethylene overproducer 1，ETO1）是 一 种BTB蛋 白，作 为CUL3a/b E3连接酶复合物的底物招募成分［43-44］。ETO1以及ETO1的同源蛋白EOL1（ETO1-like）和EOL2与2型ACS发生物理作用，并通过促进ACS的降解而负调控乙烯的生物合成［44-45］。由于eto1-3突变体产生截断ETO1蛋白质，不能靶向ACS5用于蛋白酶体降解，因此引起变异植物中乙烯的增加［44］。在土壤上生长的拟南芥eto1-3突变体提高了CBF1/2/3转录水平而使植株具有更强的抗冻性［46］。表明乙烯通过控制CBF基因表达来正调控抗冻性，而ETO1通过负调控ACS水平而影响植物的抗冻性。

3.1.2 蛋白质泛素化介导乙烯信号转导 在拟南芥中，乙烯由5个位于内质网膜上的乙烯受体1（ethylene response1，ETR1）、ETR2、乙烯传感蛋白（ethylene response sensor1，ERS1）、ERS2和乙烯不敏感4（ethylene insensitive4，EIN4）感知。乙烯受体和激酶组成型三重反应突变体（constitutive triple response1，CTR1）都是乙烯信号途径中的抑制因子；乙烯不敏感2（ethylene insensitive2，EIN2）是跨膜蛋白；EIN3和EIL1（EIN3-LIKE1）蛋白存在于细胞核中，是乙烯信号途径中的关键转录因子，它们可以调节属于WRKY、AP2/ERF和NAC转录因子基因家族的转录因子。在乙烯不存在的情况时，受体处于活化状态，激活CTR1。CTR1磷酸化同样位于内质网膜上的跨膜蛋白EIN2的C端结构域。磷酸化后的EIN2 C端结构域可以被F-box蛋白ETP1/2（EIN2 TARGETING PROTEIN1/2）识别并进入蛋白酶体降解［47-48］。EIN 3/EIL1被EBF 1/2这两个F-box蛋白降解，从而抑制乙烯反应。当乙烯存在时，乙烯与受体ETR1二聚体结合，并使其失活，从而导致CTR1失活。CTR1对EIN2的磷酸化被抑制，EIN2被激活。一部分EIN2进入细胞核，通过有丝分裂原活化蛋白激酶激酶激酶（mitogen activated protein kinase kinase kinase，MAPK3）对EIN3/EIL1磷酸化来抑制EBF1和EBF2介导的EIN3/EIL1的降解，直接或间接的激活或稳定EIN3/EIL1蛋白［49-50］。EIN3lEIL 1形成二聚体激活乙烯下游响应基因CBF的表达，进而启动转录级联反应，激活或者抑制抗冻相关基因的表达（图2和表1）。

图2 E3s参与乙烯途径调控拟南芥抗冻性示意图Fig. 2 Schematic diagram depicts the involvement of E3s in regulation of freezing stress tolerance by the ethylene（ET）pathway in Arabidopsis

在拟南芥中，低温胁迫条件下，EBF1蛋白以依赖EIN2的方式被降解，EIN3水平增加［40］。进一步研究发现，EIN3蛋白能够与CBFs基因和A型ARR基因的启动子区特定元件相结合，负调控CBFs基因和ARR基因表达，从而降低拟南芥抗冻性［40］，这表明E3连接酶EBF正调控拟南芥的抗冻性。

3.2 蛋白质泛素化介导茉莉酸信号转导

冷胁迫诱导茉莉酸（jasmonates，JA）生物合成基因（如拟南芥LOX1、AOS1和AOC1和JAR1［51］和水稻OsAOS、OsOPR1、OsAOC和OsLOX［52］）的表 达，迅速提高这些植物内生JA水平。外源JA处理提高了拟南芥抗冻性。与野生型植物相比，拟南芥缺乏JA生物合成或信号转导突变体（如lox2、aos、jar1和coi1）对冰冻胁迫的敏感性增加［51］。这些研究表明JA正调控植物抗冻性［53］。拟南芥茉莉酮酸酯ZIM结构域蛋白JAZ（jasmonate zim-domain）是抗冻性调节因子［51］。在非低温胁迫条件下，JAZ1和JAZ4蛋白与ICE1和ICE2相互作用，抑制后者转录活性，阻止非特异性的寒冷胁迫反应的激活［51］。在寒冷胁迫下，JA水平增加，触发F-box E3 COI1介导的JAZ降解，使ICEs从抑制中释放出来。然后，ICE1和ICE2通过与CBFs基因启动子中DRE/CRT序列元件结合来激活CBFs的表达［51，53］。

4 参与低温胁迫反应的功能蛋白的泛素化 修饰

F-box蛋白FBP7是拟南芥多亚基E3 SCF复合体的组成部分［54］。冷诱导FBP7的表达激活，而FBP7的激活是重新合成冷诱导蛋白质所必需的［54］。已发现FBP7酵母同源物YLR097c与蛋白翻译延长因子eEF-2互作，推测它可能影响温度胁迫后蛋白质合成过程。另外，在拟南芥los1-1突变体中冷诱导的蛋白质合成被抑制的方式与fbp7突变体相同［55］。因此可以推测拟南芥FBP7将与LOS1蛋白（eEF-2的同源物）相互作用，但这种相互作用及其伴随的泛素化仍有待进一步研究。由于fbp7突变体中LOS1蛋白水平没有改变，推测FBP7可能调节LOS1活性或亚细胞定位。由于LOS1介导的冷诱导蛋白质合成是适当的冷驯化所必需的［54］，可以预测在冷驯化过程中FBP7通过调节LOS1功能而发挥作用。

辣椒PUB1（Capsicum annuum putative U-box protein 1，CaPUB1）是一种U-box E3，参与非生物胁迫早期抗性反应，被非生物胁迫（如干旱、低温和机械损伤）快速诱导表达［56］。CaPUB1在拟南芥中过表达，减少了CaPUB1底物蛋白RPN6表达量。而RPN6的减少会引起植株生长加速和增强对干旱、盐胁迫的敏感性［56］。RPN6是26S蛋白酶体19S调节颗粒lid亚基复合物的成员之一，在蛋白质底物降解前将泛素链从蛋白质底物上剪切掉以回收再次利用（去泛素化）。RPN6含有PCI（proteasome-COP9/signalosome-eIF3）模块，可能在蛋白酶体组装中起脚手架作用［57］。与在拟南芥中的作用相同的是CaPUB1在水稻中过表达，与野生型植物相比也降低植株抗旱性，但同时冷胁迫诱导标记基因DREB1A、DREB1B、DREB1C和细胞色素P450明显上调，从而提高植株低温抗性［58］。这表明CAPUB1既是干旱胁迫响应的负调节因子，也是转基因水稻冷胁迫响应的正调节因子。这也表明CaPUB1可能参与干旱和低温信号通路的交叉作用。

AtCHIP是存在于拟南芥中的一个CHIP-like蛋白，它含有3个TPRs（tetratricopeptide repeats）和一个U-box结构域，在结构上与动物CHIP蛋白相似［59］。AtCHIP在体外具有E3泛素连接酶活性。在低温处理条件下，AtCHIP转录水平上调，与野生型相比，过表达AtCHIP植株在冷胁迫下生长减慢并发生严重的膜损伤，对低温处理的敏感性增强［59］。这些结果表明AtCHIP在温度胁迫条件下植物细胞代谢中起重要作用。利用酵母双杂交技术鉴定了与AtCHIP发生物理作用的蛋白之一——蛋白磷酸酶PP2A（protein phosphatase 2A）A3亚基；与野生型植物相比，过表达AtCHIP使PP2A在黑暗或低温条件下具有更高的活性，这表明AtCHIP对PP2A的泛素化修饰在一定条件下提高了PP2A的活性［60］。因此，过表达AtCHIP植物的低温敏感表型可能部分是由于PP2A活性的变化所引起。

除了靶向蛋白降解外，E3还可以通过对UPS相关蛋白的修饰来控制蛋白质的周转。SAP9是一种20/AN1型锌指蛋白，参与拟南芥发育和多种胁迫反应的调控。寒冷等胁迫诱导SAP9的表达［61］。SAP9显示E3泛素连接酶活性，并与Rad23d相互作用。Rad23d是将泛素化底物转运到蛋白酶体的穿梭因子［61］。SAP9可以促进泛素化底物与RAD23的相互作用，从而保证泛素化底物的降解。

5 总结与展望

植物对低温胁迫的抗性涉及生长发育、生理和生化变化，这些变化限制了植物受损伤程度，并重新建立稳态，促进受损系统的修复。因此，了解低温胁迫抗性的调控机制非常重要。大量研究表明低温胁迫反应需要一组转录因子的协同作用。这些转录因子在低温胁迫反应中的重要功能可能是受翻译后修饰调控的，包括泛素化、磷酸化、类泛素化，如ICE1。UPS在植物低温胁迫反应中起着重要作用。除已明确的ICE1、MBY和HY5等转录因子外，可能有其他的转录因子通过泛素化修饰调控植物低温胁迫反应。尽管已经明确E3介导的茉莉酸和乙烯等激素信号途径在调控植物低温胁迫反应中具有重要作用，但相关研究还很不足，有待于进一步深入研究。低温引起细胞代谢的变化，最终实现植物低温胁迫抗性。其中许多代谢变化受泛素化修饰调节。对参与低温胁迫反应的代谢产物合成的蛋白或酶进行泛素化修饰的E3也知之甚少。总之，目前参与植物低温胁迫反应的大量E3仍然是未知的。因此，发现并鉴定与低温胁迫反应相关的E3的生物学功能是一项重要的任务。此外，E3的功能取决于其靶蛋白的性质，也就是说，目标蛋白是否是低温胁迫反应的正调节因子或负调节因子。因此对单个E3靶蛋白的破译将有助于理解泛素化的更详细、更精确的机制。通过蛋白质组学研究发现了一些植物中低温诱导了E3的明显上调，如笃斯越桔（Vaccinium uligiuosum）的E3泛素蛋白连接酶ARI2［62］，或者通过异位表达葡萄（Vitis amurensis）的VaPUB正调控拟南芥的低温胁迫反应［63］，但这些E3作用的靶蛋白仍不清楚。

本综述中描述的泛素化修饰靶蛋白大都是利用传统的分子方法获得的单一蛋白。直到最近，还没有关于与低温胁迫反应有关的泛素化修饰的蛋白质组全范围分析的报道。大规模蛋白质组学分析产生的结果与对低温胁迫反应特定关键效应蛋白（或基因）的详细遗传学研究相结合，可以提供关键数据，以阐明控制低温胁迫反应的分子机制。因此，制定相应的鉴定方案，准确地揭示真正的目标蛋白是未来的一个巨大挑战。在研究了单个E3连接酶（包括分析其生物学功能和底物）之后，构建由不同信号通路连接的调控网络对于加深对泛素化在植物低温胁迫反应中的神秘作用的理解至关重要。对这些问题的回答将有助于深入了解植物低温胁迫反应的泛素化修饰的调控机制。

生产实践中，解决农作物及林木低温胁迫的最主要的途径是开发并推广种植抗寒品种。对更多参与低温胁迫调控的泛素连接酶的分析及其相互作用蛋白的鉴定将为植物低温胁迫在翻译后修饰水平上的调控研究提供新线索，并最终为构建植物低温胁迫的调控网络和培育抗寒农作物、林木新品种提供理论依据。