红花逍遥片HPLC指纹图谱的研究

2021-08-11胡吉忠张金良兰晓峰饶毅谢子文刘厚权陈广云夏淑英康兴东

特产研究 2021年4期

胡吉忠，张金良，兰晓峰，饶毅，谢子文，刘厚权，陈广云，夏淑英，康兴东※

（1.江西普正制药股份有限公司，江西吉安 343100；2.江西中医药大学，江西南昌 330006）

红花逍遥片源于宋代《太平惠民和剂局方》中的中医经典名方“逍遥散”，经云南彝族传统医籍《哀牢本草》改进而成，处方中包括当归、竹叶柴胡、红花、白芍、白术、茯苓、皂角刺、薄荷和甘草等药材，具有舒肝、理气和活血等功效[1]。红花逍遥片在临床上常用于治疗月经后期、经前期综合征、更年期综合征、乳腺增生和黄褐斑等症[2-6]。目前红花逍遥片的质量控制主要是对芍药苷、甘草苷、芍药内酯苷、羟基红花黄色素A及甘草酸等指标成分进行含量测定[7,8]，缺少对红花逍遥片整体的质量控制。本实验研究建立了红花逍遥片的HPLC指纹图谱方法，再通过产品整体性的相似度评价，对主要色谱峰来源进行归属[9,10]，提升了红花逍遥片的整体质量评价和控制能力，为进一步保障产品质量提供了依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器设备

Waters 2695-2998型高效液相色谱仪（美国沃特世公司，含四元泵、自动进样器、检测器）；AUW2200十万分之一电子分析天平（日本岛津公司）；AB104-N万分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；JK-300型超声波清洗仪（合肥金尼克机械制造有限公司）。

1.2 试剂与试药

芍药苷对照品（批号：110736-201943）、甘草苷对照品（批号：111610-201607）、甘草酸铵对照品（批号：110731-201720）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈（色谱纯）和乙醚（分析纯）购自西陇科学股份有限公司；甲醇（分析纯）购自天津市恒兴化学试剂有限公司；冰醋酸（分析纯）购自天津市富宇精细化工有限公司；乙醇（分析纯）购自天津市致远化学试剂有限公司；水均是自制超纯水。红花逍遥片共10批（江西普正制药有限公司，批号分别为180101、180302、180404、180502、180605、180701、181004、181103、190102和190303，规格：每片重0.39 g）。

当归、竹叶柴胡、红花、白芍、白术、茯苓、皂角刺、薄荷和甘草药材均购自樟树药材市场，经江西普正制药股份有限公司吴永忠研究员鉴定当归为伞形科植物当归[Angelica sinensis（Oliv.）Diels]的干燥根，白芍为毛茛科植物芍药（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根，白术为菊科植物白术（Atractylodes macrocephala Koidz.）的干燥根茎，茯苓为多孔菌科真菌茯苓[Poria cocos(Schw.)Wolf]的干燥菌核，红花为菊科植物红花（Carthamus tinctorius L.）的干燥花，皂角刺为豆科植物皂荚（Gleditsia sinensis Lam.）的干燥棘刺，薄荷为唇形科植物薄荷（Mentha haplocalyx Briq.）的干燥地上部分，甘草为豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch）的干燥根和根茎，竹叶柴胡为伞形科植物膜缘柴胡（Bup-leurum marginatum Wall．ex DC．）的干燥带根全草。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Diamonsil C18柱（250 mm 4.6 mm，5m）；以乙腈为流动相A，0.1%的冰醋酸为流动相B，梯度洗脱：0~10 min，12%~16%乙腈；10~25 min，16%~20%乙腈；25~30 min，20%~22%乙腈；30~40 min，22%~33%乙腈；40~50 min，33%~40%乙腈；50~60 min，40%~50%乙腈；60~70 min，50%~65%乙腈；进样量10L；流速为1 mL/min，检测波长为230 nm；柱温25℃，理论板数按芍药苷峰计算应不低于2 000。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备分别精密称取适量的甘草苷、甘草酸及芍药苷对照品，加甲醇制成每1 mL含50g对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备取红花逍遥片10片，除去薄膜衣，研细，取约0.35 g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，超声处理25 min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45m微孔滤膜滤过，即得。

2.2.3 各单味药材溶液制备分别取当归、竹叶柴胡、红花、白芍、白术、茯苓、皂角刺、薄荷和甘草等9味药材各约30 g，分别加入300 mL水浸泡40 min，加热煮沸后，文火慢煎2 h，放冷，纱布滤过，第2次煎煮加入200 mL水，加热煮沸后，文火慢煎2 h，纱布滤过，合并两次煎液，滤液浓缩成至相对密度为1.40（50℃）的稠膏，干燥，粉碎，得干燥浸膏粉。按处方量分别称取浸膏粉，精密称定质量，按2.2.2供试品溶液的制备方法制备，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法取红花逍遥片样品制备1份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，测定的指纹图谱用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）分析，结果显示，不同批次间相似度均值为0.996，说明该方法精密度良好。

2.3.2 重复性试验按“2.2.2”项下供试品溶液制备的方法取红花逍遥片样品平行制备6份提取物溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，测定的指纹图谱用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）分析，结果显示，不同批次间相似度达到0.95以上，说明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法取红花逍遥片样品制备供试品溶液，分别于0、3、6、9、12、24h后按“2.1”项下色谱条件进样，测定的指纹图谱用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）分析，结果显示，不同批次间共有峰相对保留时间的相对标准偏差为0~0.42%，相对峰面积的相对标准偏差为0~5.08%，相似度为0.996~1.000，表明本方法在24 h内稳定性良好。

2.4 红花逍遥片HPLC指纹图谱的建立

2.4.1 共有峰的确定按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法取10批红花逍遥片样品制备样品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，测定的10批指纹图谱用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）分析，选取峰面积较大且分离度较好的10个色谱峰作为红花逍遥片指纹图谱共有特征峰。

2.4.2 相似度评价将10批红花逍遥片指纹图谱用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）分析，以S1（批号180101）为参照图谱，设定时间宽度为0.1 min，多点校正，中位法生成10批红花逍遥片指纹图谱共有模式图（图1），进而建立红花逍遥片的对照指纹图谱（图2），相似度结果见表1。10批红花逍遥片HPLC指纹图谱相似度均在0.95以上，说明10批产品的批间质量稳定性良好。

表1 红花逍遥片HPLC指纹图谱相似度Table 1 The HPLC fingerprint similarity of Honghua Xiaoyao Tablets

图1 10批红花逍遥片指纹图谱共有模式图Fig.1 The common pattern of fingerprint spectrum for 10 batches of Honghua Xiaoyao Tablets

图2 红花逍遥片对照指纹图谱Fig.2 The fingerprint spectrum of Honghua Xiaoyao Tablets

2.5 峰指认研究

红花逍遥片供试品溶液和甘草苷、甘草酸、芍药苷对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，测定的红花逍遥片及对照品指纹图谱用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）分析，结果见图3，确认峰4、峰6和峰11分别为芍药苷、甘草苷和甘草酸。

图3 混合对照品及红花逍遥片的供试品HPLC图Fig.3 HPLC diagrams of the mixed reference substance and Honghua Xiaoyao Tablets

2.6 谱峰归属研究

将红花逍遥片的各单味药材溶液按“2.1”项下色谱条件进样，测定的指纹图谱与红花逍遥片对照指纹图谱叠加，各药材的色谱峰与红花逍遥片对照图谱共有峰对应，表明药材到红花逍遥片产品的质量传递过程有良好的相关性和一致性，保留了主要化学成分。再进行色谱峰归属，将红花逍遥片对照指纹图谱中的共有峰追溯到各单味药材，结果见图4。试验结果可得，峰1、峰5来自于竹叶柴胡药材；峰3、峰4（S）来自于白芍药材；峰6、峰8、峰11来自于甘草药材；峰7来自于薄荷药材；共有峰2来自于红花、甘草药材；共有峰9来自于甘草、薄荷药材；共有峰10来自于甘草、白芍药材；另外白术、当归、茯苓与成品的HPLC共有峰未有明显的峰归属关系。结果显示红花逍遥片与其组方药材之间存在良好的相关性，较好地反映了产品质量，使产品质量具有较好的可追溯性。