木姜叶柯叶黄酮类化学成分研究

魏文文，刘振昌，温应宁

（1.中国科学院华南植物园，中国科学院植物资源保护与可持续利用重点实验室，广东 广州 510650；2.惠州市农业科学研究所，生物技术研究室，广东 惠州 516023）

木姜叶柯叶[Lithocarpus litseifolius(Hance)Chun]称甜茶，系壳斗科柯属常绿植物，是一种药、食两用的珍贵植物[1]。木姜叶柯叶甘甜清爽，不仅具有很好的药理保健功能，而且还有“二抗双降”（抗氧化、抗癌变、降血糖、降血脂）的作用[2-5]。根据文献报道，木姜叶柯叶的黄酮类化合物是其主要成分和功能性物质[2,4]，目前对木姜叶柯叶的黄酮类化合物尚未进行深入地研究，故选取木姜叶柯叶作为研究材料，对其进行分离研究，以促进其资源的开发利用。

1 材料仪器

柱层析用硅胶（青岛海洋化工有限公司）；柱层析反相硅胶Develosil ODS（粒径75m，日本富士化学公司）；Sephadex LH-20（瑞典Amersham Biosciences公司）；柱层析用MC（I德国Merck公司）；薄层层析板TLC（烟台江友硅胶开发有限公司）；反相（RP-18）TLC板（德国Merck公司）；ESI-MS（美国Applied Bio-systems公司）；1H NMR和13C NMR（Bruker DRX-500型，瑞士Bruker公司）；半制备HPLC（日本Shimadzu公司）；所用试剂为分析纯或色谱纯。

木姜叶柯叶于2013年3月采自广东省惠州市罗浮山，由中国科学院华南植物园刑福武研究员鉴定，晾干后粉碎备用。

2 提取分离

木姜叶柯叶干粉2.77 kg，用95%的乙醇室温浸泡提取4次，每次48 h，减压浓缩得乙醇浸膏0.97 kg，乙醇提取物用20%的乙醇沉淀过夜，离心，得到沉淀（259 g）和上清液（463 g）两部分。沉淀经正相硅胶柱层析（柱长1.2 m，内径10 cm，载样量518 g），以三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，收集流份，TLC检查后合并为15个组分（St-1~St-15）。

St-8（5.5 g）经反相硅胶柱层析，以甲醇-水（10:90~90:10,v/v）洗脱，经TLC检查，合并相同组分，共得到11个亚组分（St-8-a~St-8-k）。St-8-d经葡聚糖凝胶，以甲醇洗脱，TLC检查后合并得到3个亚组分（St-8-d-1~St-8-d-3），从St-8-d-2中得到化合物3（5 mg）和4（4 mg）。St-8-e经葡聚糖凝胶，以甲醇洗脱，TLC检查后合并得到4个亚组分（St-8-e-1~St-8-e-4），St-8-e-3经正相硅胶（95:5,v/v），得到化合物2（4 mg）。St-9（5.5 g）经反相硅胶柱层析，以甲醇-水（50:50~90:10,v/v）洗脱，经TLC检查，合并相同组分，共得到15个亚组分（St-9-a~St-9-o）。St-9-c经HPLC制备以甲醇-水（45:55,v/v）作为流动相，流速10 mL min-1，分离得到化合物8（tR 87 min,10 mg）。St-10-g经葡聚糖凝胶，以甲醇洗脱，TLC检查后合并得到4个亚组分（St-10-g-1~St-10-g-4），St-10-g-2经TLC检查为一纯物质，得到化合物5（8 mg）。St-12经正相硅胶柱层析，以三氯甲烷-甲醇（10:0~7:3,v/v）梯度洗脱，收集流份，TLC检查后合并为10个亚组分（St-12-a~St-12-j）。St12-g（3.6g）经反相硅胶柱层析，以甲醇-水（40:60~80:20,v/v）洗脱，经TLC检查，合并相同组分，共得到14个亚组分（St-12-g-1~St-12-g-14）。St-12-g-5经葡聚糖凝胶，以甲醇洗脱，TLC检查后合并得到4个亚组分（St-12-g-5-a~St-12-g-5-d），St-12-g-5-d经正相硅胶（85:15,v/v），得到化合物9（7 mg）。St-12-g-5-c经HPLC制备以甲醇-水（45:55,v/v）作为流动相，流速5 mL min-1，分离得到化合物6（tR 62 min,5 mg）。St-12-g-8-d经HPLC制备以甲醇-水（47:53,v/v）作为流动相，流速5 mL min-1，分离得到化合物7（tR 96 min,2 mg）。St-12-g-7经葡聚糖凝胶，以甲醇洗脱，TLC检查后合并得到3个亚组分（St-12-g-7-a~St-12-g-7-c），St-12-g-7-b经HPLC制备以甲醇-水（47:53,v/v）作为流动相，流速5 mL min-1，分离得到化合物1（tR 59 min,10 mg）。St-12-g-11经葡聚糖凝胶，以甲醇洗脱，TLC检查后合并得到4个亚组分（St-12-g-11-a~St-12-g-11-d），St12-g-11-d经检测为一纯物质，得到化合物10（6 mg）。

3 结构鉴定

化合物1 淡黄色粉末，ESI-MS m/z 479[M+H]+,501[M+Na]+,477[M H],955[2M H];1H NMR(500 MHz,DMSO-d6) 7.03(2H,d,J=8.4 Hz,H-2,H-6),6.64(2H,d,J=8.4 Hz,H-3,H-5),6.10(1H,d,J=1.8 Hz,H-3'),5.93(1H,d,J=1.8 Hz,H-5'),3.34(2H,m,H-),2.77(2H,t,J=7.4 Hz,H-),4.97(1H,d,J=7.3 Hz,H-1''),3.34(4H,m,H-2'',H-3'',H-4'',H-5''),4.30(1H,dd,J=11.8Hz,1.7 Hz,H-6''),4.10(1H,dd,J=11.9Hz,6.7 Hz,H-6''),1.99(3H,s,-CH3CO);13C NMR(125MHz,DM50-d6) 131.5(C-1),129.1(C-2,C-6),115.0(C-3,C-5),155.3(C-4),204.5(C=O),105.0(C-1'),160.5(C-2'),94.0(C-3'),164.9(C-4'),97.0(C-5'),165.3(C-6'),44.9(C-),29.0(C-),100.6(C-1''),73.1(C-2''),76.4(C-3''),69.7(C-4''),73.9(C-5''),63.2(C-6''),170.2(-CO),20.6(-CH3).对照文献[6]数据，确定化合物为2'-O-(6-O-乙酰葡萄糖苷)-4,4',6'-三羟基二氢查耳酮。

化合物2 淡黄色针晶，ESI-MS m/z 285[M+H]+,307[M+Na]+,591[2M+Na]+,283[M H],567[M H],603[2M+Cl];1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)6.84(1H,s,H-3),12.89(1H,s,5-OH),6.19(1H,d,J=1.9 Hz,H-6),6.49(1H,d,J=1.9 Hz,H-8),3.83(3H,s,4'-OCH3),8.01(2H,d,J=8.9 Hz,H-2',H-6'),7.08(2H,d,J=8.9 Hz,H-3',H-5'),13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)163.3(C-2),103.6(C-3),181.8(C-4),157.4(C-5),98.9(C-6),164.3(C-7),94.1(C-8),161.4(C-9),103.8(C-10),122.9(C-1'),128.3(C-2',C-6'),114.6(C-3',C-5'),162.3(C-4'),55.6(-OCH3).对照文献[7]数据，确定化合物为5,7-二羟基-4'-甲氧基黄酮。

化合物3淡黄色粉末，1HNMR(500MHz,MeOD)6.98(1H,s,H-3),6.20(2H,m,H-6),6.55(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),3.88(6H,s,-OCH3);13C NMR(125 MHz,MeOD) 163.7(C-2),102.2(C-3),181.8(C-4),161.4(C-5),98.9(C-6),164.3(C-7),94.2(C-8),157.9(C-9),103.7(C-10),125.9(C-1'),104.2(C-2'),148.2(C-3'),139.7(C-4'),148.2(C-5'),104.2(C-6'),56.4(-OCH3).对照文献[8]数据，确定化合物为4',5,7-三羟基-3',5'-二甲氧基黄酮。

化合物4 淡黄色粉末，1H NMR (500MHz,MeOD) 6.90(1H,s,H-3),6.20(2H,m,H-6),6.47(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),3.75(6H,s,-OCH3);13C NMR(125 MHz,MeOD) 163.2(C-2),103.6(C-3),181.8(C-4),161.5(C-5),99.0(C-6),164.6(C-7),94.1(C-8),157.9(C-9),103.8(C-10),120.4(C-1'),107.7(C-2'),153.6(C-3'),139.9(C-4'),150.9(C-5'),104.7(C-6'),56.2(-OCH3).对照文献[8]数据，确定化合物分别为3',5,7-三羟基-4',5'-二甲氧基黄酮。

化合物5 淡黄色针晶，ESI-MS m/z 271[M+H]+,293[M+Na]+,283[M H],269[M H],539[2M H];1H NMR(500 MHz,DMSO-d6)6.77(1H,s,H-3),12.96(1H,s,5-OH),6.18(1H,d,J=1.9 Hz,H-6),6.47(1H,d,J=1.9 Hz,H-8),7.92(2H,d,J=8.9 Hz,H-2',H-6'),6.92(2H,d,J=8.9 Hz,H-3',5');13CNMR(125 MHz,DMSO-d6) 163.8(C-2),102.8(C-3),181.8(C-4),157.3(C-5),98.9(C-6),164.3(C-7),94.0(C-8),161.2(C-9),103.7(C-10),121.2(C-1'),128.5(C-2',C-6'),116.0(C-3',C-5'),161.5(C-4').对照文献[7]数据，确定化合物为4',5,7-三羟基黄酮。

化合物6 黄色无定形粉末，ESI-MS m/z 455[M+Na]+,471[M+K]+,887[2M+Na]+,431[M H],863[2M H];1HNMR(500 MHz,DMSO-d6)6.19(1H,d,J=1.8 Hz,H-6),6.47(1H,d,J=1.8 Hz,H-8),7.74(2H,d,J=8.7 Hz,H-2',H-6'),6.91(2H,d,J=8.7 Hz,H-3',H-5'),5.29(1H,d,J=1.0 Hz,H-1''),0.79(3H,d,J=6.0 Hz,H-6'');13C NMR(125 MHz,DMSO-d6) 156.6(C-2),134.2(C-3),177.7(C-4),161.2(C-5),98.9(C-6),164.9(C-7),93.9(C-8),157.2(C-9),103.9(C-10),120.5(C-1'),130.6(C-2',6'),115.4(C-3',C-5'),160.0(C-4'),101.8(C-1''),70.3(C-2''),70.6(C-3''),71.7(C-4''),70.1(C-5''),17.6(C-6'').对照文献[9]数据，确定化合物为阿福豆苷。

化合物7 淡黄色粉末，ESI-MS m/z 595[M+H]+,618[M+Na]+,1211[2M+Na]+,593[M H];1H NMR(500 MHz,DMSO-d6) 7.95(2H,d,J=8.7 Hz,H-2',H-6'),6.82(2H,d,J=8.7 Hz,H-3',H-5'),5.36(1H,d,J=7.6 Hz,H-1''),3.17-3.30(4H,m,H-2'',H-3'',H-4'',H-5''),4.28(1H,d,J=10.9 Hz,H-6''),4.02(1H,dd,J=12.0 Hz,6.4 Hz,H-6''),7.39(2H,d,J=8.5 Hz,H-2''',H-6'''),6.79(2H,d,J=8.5 Hz,H-3''',H-5'''),7.37(1H,d,J=15.7 Hz,H-7'''),6.15(1H,d,J=18.0 Hz,H-8''').对照文献[10]数据，确定化合物为山柰酚-3-O--d-(6″-p-香豆酰)-吡喃葡萄糖苷。

化合物8 黄色无定形粉末，ESI-MS m/z 295[M+Na]+,271[M H],543[2M H];1HNMR(500 MHz,MeOD) 5.34(1H,dd,J=12.9 Hz,2.8 Hz,H-2),3.11(1H,dd,J=17.1 Hz,13.0 Hz,H-3),2.70(1H,dd,J=17.1 Hz,3.0 Hz,H-3),5.89(2H,dd,J=6.9 Hz,2.1 Hz,H-6,H-8),7.31(2H,d,J=8.5 Hz,H-2',H-6'),6.82(2H,d,J=8.5 Hz,H-3',H-5');13C NMR(125 MHz,MeOD)80.5(C-2),44.0(C-3),197.8(C-4),165.5(C-5),97.0(C-6),168.4(C-7),96.2(C-8),164.9(C-9),103.3(C-10),131.1(C-1'),129.0(C-2',C-6'),116.3(C-3',C-5'),159.0(C-4').对照文献[11]数据，确定化合物为柚皮素。

化合物9 黄色无定形粉末，ESI-MSm/z 287[M H],323[M+Cl],575[2M H];1H NMR(500 MHz,DMSO-d6) 5.37(1H,dd,J=12.5 Hz,3.0 Hz,H-2),3.20(1H,m,H-3),2.68(1H,dd,J=17.1 Hz,3.0 Hz,H-3),5.89(2H,s,H-6,H-8),6.75(2H,s,H-2',H-6'),6.88(1H,s,H-4');13C NMR(125 MHz,DMSO-d6) 78.5(C-2),42.1(C-3),196.3(C-4),162.9(C-5),95.8(C-6),166.9(C-7),95.0(C-8),163.5(C-9),101.7(C-10),129.5(C-1'),114.4(C-2'),145.2(C-3'),145.7(C-4'),115.4(C-5'),117.9(C-6').对照文献[12]数据，确定化合物为3',5,5',7-四羟基黄酮烷。

化合物10 淡黄色粉末，ESI-MS m/z 763[M+Na]+,739[M H],1479[2M H];1H NMR(500 MHz,DMSO-d6) 6.12(1H,d,J=2.0 Hz,H-6),6.37(1H,d,J=2.0 Hz,H-8),7.98(2H,d,J=8.9 Hz,H-2',H-6'),6.88(2H,d,J=8.9 Hz,H-3',H-5'),5.71(1H,d,J=8.1 Hz,H-1''),4.92(1H,m,H-2''),4.30(1H,d,J=10.2 Hz,H-6''),7.39(2H,d,J=8.7 Hz,H-2''',H-6'''),6.86(2H,d,J=8.7 Hz,H-3''',5'''),7.36(1H,d,J=15.8 Hz,H-7'''),6.13(1H,d,J=15.8 Hz,H-8'''),7.57(2H,d,J=8.7 Hz,H-2'''',H-6''''),6.80(2H,d,J=8.7 Hz,H-3'''',H-5''''),7.61(1H,d,J=15.8 Hz,H-7'''');13C NMR(125 MHz,DMSO-d6)156.3(C-2),132.5(C-3),170.0(C-4),161.1(C-5),98.9(C-6),165.3(C-7),93.7(C-8),156.2(C-9),103.7(C-10),120.6(C-1'),132.7(C-2',C-6'),115.2(C-3',C-5'),160.1(C-4'),98.2(C-1''),73.8(C-2''),73.7(C-3''),70.2(C-4''),74.3(C-5''),62.7(C-6''),124.9(C-1'''),130.2(C-2''',C-6'''),115.4(C-3''',C-5'''),158.8(C-4'''),143.2(C-7'''),113.5(C-8'''),166.1(C-9'''),125.4(C-1''''),130.8(C-2'''',C-6''''),115.8(C-3'''',C-5''''),159.9(C-4''''),144.7(C-7''''),114.9(C-8''''),165.2(C-9'''').对照文献[13]数据，确定化合物为山柰酚-3-O-[6",2"-di-O-(E)-p-香豆酰]--d-葡萄糖苷。10个黄酮化合物的和结构式见图1。

图1 10个黄酮化合物结构式Fig.1 The structural formulas of ten flavone compounds

4 结论和讨论

本试验利用乙醇浸提、溶剂萃取、正反相硅胶柱及凝胶柱色谱层析等分离手段，从木姜叶柯叶中分离得到了10个化合物，通过光谱分析及与文献比对，分别鉴定为2'-O-(6-O-乙酰葡萄糖苷)-4,4',6'-三羟基二氢查耳酮（1）、5,7-二羟基-4'-甲氧基黄酮（2）、4',5,7-三羟基-3',5'-二甲氧基黄酮（3）、3',5,7-三羟基-4',5'-二甲氧基黄酮（4）、4',5,7-三羟基黄酮（5）、阿福豆苷（6）、山柰酚-3-O--d-(6″-p-香豆酰)吡喃葡萄糖苷（7）、柚皮素（8）、3',5,5',7-四羟基黄酮烷（9）、山柰酚-3-O-[6",2"-di-O-(E)-p-香豆酰]--d-葡萄糖苷（10），其中化合物1、7、10首次从该植物中分离得到。

本研究以木姜叶柯叶为原料，对其化学成分展开了系统分离与鉴定研究，结果表明黄酮和二氢查耳酮为木姜叶柯叶的主要化学成分，这对于推进木姜叶柯的进一步研究和开发利用具有积极意义。