对香豆酸改善嗅球切除小鼠抑郁样行为及其AMPA受体机制

肖煦晖，李惠蓉，肖志勇，李金成，肖楚丽

(1. 邵阳学院基础医学院，2. 湘西南中药开发利用湖南省工程研究中心，湖南 邵阳 422000；3. 南华大学附属第一医院，湖南 衡阳 421001)

抑郁症是一种常见的神经精神疾病，约25%的人在其一生的某个时期遭受抑郁症的困扰[1]。一线抗抑郁药物存在起效慢、有效率低、毒副作用强等缺点，因此亟需开发低毒有效的抗抑郁药物。

α-氨-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体(AMPA受体)是一种离子型谷氨酸受体，通过快钠离子通道的激活和失活介导哺乳动物中枢神经系统兴奋性谷氨酸的快速传递。研究表明，AMPA受体与突触可塑性密切相关，并且参与抑郁症的发生发展[2]。NBQX是选择性AMPA受体拮抗剂，可竞争性与AMPA受体结合，进而阻断多种药物的抗抑郁样作用；CX546是AMPA受体选择性激动剂，可增强抗抑郁药物的作用，这些证据表明AMPA受体参与多种药物的抗抑郁样作用[3-4]。

对香豆酸(p-coumaric acid，p-CA)是一种衍生自芳香族氨基酸的苯丙酸，具有抗氧化、抗疟原虫和抗炎免疫作用[5-7]。越来越多的研究报道p-CA可改善脑缺血和记忆障碍[8-9],然而p-CA对抑郁症中的作用却研究甚少，特别地，在嗅球切除抑郁模型中的作用未见报道。该文拟建立嗅球切除(OBX)小鼠抑郁模型研究p-CA的抗抑郁作用，此外，考虑到p-CA可上调AMPA受体介导的场电位[10]，因此我们应用AMPA受体拮抗剂NBQX和AMPA受体激动剂CX546，进一步研究其对p-CA抗抑郁样作用的影响，以及明确AMPA受体对p-CA的抗抑郁样行为有无关联。

1 材料与方法

1.1 实验动物6W ICR小鼠，♂，许可证号：SCXK(湘)2019-0004，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司。(23±2) ℃，明暗周期12 h(其中7 ∶00-17 ∶00为明)的实验动物房中，自由摄食和饮水。

1.2 主要药物对香豆酸，购于阿拉丁公司，浓度为75 mg·kg-1[6]；NBQX购于Selleck公司，浓度为0.5 mg·kg[6]；CX546购于MCE公司，溶于生理盐水中，剂量1 mg·kg-1,药物和溶媒的注射体积为10 mL·kg-1。

1.3 实验设计

1.3.1实验1 p-CA对OBX小鼠抑郁样行为的影响。小鼠随机分成对照组(Control)，假手术组(SHAM)，嗅球切除组(OBX)和嗅球切除+p-CA组(OBX+ p-CA)，每组9只，其中嗅球切除小鼠进行嗅球摘除手术，假手术组小鼠除不摘除嗅球外其它手术过程相同，而对照组小鼠不进行手术，手术后各组小鼠恢复21 d。d 22-24小鼠每天腹腔注射溶媒(10%吐温80)或p-CA(75 mg·kg-1)，共3次，最后一次注射后1 h进行旷场测试(OFT)，注射后3 h强迫游泳测试(FST)，药物注射后24 h进行悬尾测试。观察小鼠在行为测试中的表现。

1.3.2实验2 NBQX对p-CA改善OBX小鼠抑郁行为的影响。小鼠随机分成嗅球切除组(OBX)，嗅球切除+NBQX组(OBX+NBQX)，嗅球切除+p-CA组(OBX+ p-CA)，嗅球切除+NBQX+ p-CA组(OBX+ NBQX+ p-CA)，每组9只，各组小鼠进行嗅球摘除手术后小鼠恢复21 d。d 22-24 d小鼠每天腹腔注射溶媒1(10%吐温80)或p-CA(75 mg·kg-1)，共3次，最后一次注射溶媒1或p-CA前30 min注射NBQX或溶媒2。P-CA注射后1 h进行旷场测试(OFT)，注射后3 h强迫游泳测试(FST)，药物注射后24 h进行悬尾测试。观察小鼠在行为测试中的表现。

1.3.3实验3 CX546对p-CA改善OBX小鼠抑郁行为的影响。小鼠随机分成嗅球切除组(OBX)，嗅球切除+CX546组(OBX+CX546)，嗅球切除+p-CA组(OBX+p-CA)，嗅球切除+CX546+p-CA组(OBX+ CX546+ p-CA)，每组9只，各组小鼠进行嗅球摘除手术后小鼠恢复21 d。d 22-24小鼠每天腹腔注射溶媒1(10%吐温80)或p-CA(75mg/kg)，共3次，最后一次注射溶媒1或p-CA前30 min注射CX546或溶媒2。P-CA注射后1 h进行旷场测试(OFT)，注射后3 h强迫游泳测试(FST)，药物注射后24 h进行悬尾测试。观察小鼠在行为测试中的表现。

1.4 嗅球切除(OBX)小鼠麻醉后固定于脑立体定位仪上，剪毛后切开颅骨上皮肤，用双氧水腐蚀并呈现前囟点，以前囟点为原点向前5 mm，左右旁开各1 mm，用直径为2 mm颅骨钻钻孔，并捣碎嗅球，用真空泵吸出。用明胶海绵填塞孔，缝合皮肤并涂碘酒消毒。腹腔注射青霉素钠，连续3 d以防止感染。OBX术后恢复时间各异，多数选择14、21、30 d或45 d。当前研究选择术后恢复21 d。

1.5 旷场测试(OFT)[11]旷场测试在长50 cm，宽50 cm，高60 cm的隔音箱中进行，LED灯提供50 LUX的光强，排风扇提供30 Hz的背景噪音。将小鼠轻轻地放入隔音箱中10 min，通过行为分析软件Anymaze 6.10统计小鼠10 min的运动距离。每次测试前，使用75%的乙醇溶液清洁隔音箱内壁及底部[12]。

1.6 悬尾测试(TST)悬尾测试在隔音箱中进行，将小鼠鼠尾(在距尾尖1 cm处)用胶带固定于细绳上并悬挂于隔音箱顶部6 min，小鼠头部距箱底50 cm。摄像头录制该测试视频并由实验者双盲离线分析后4 min内小鼠的不动时间。

1.7 强迫游泳测试(FST)测试时将小鼠放于水深15 cm、水温(25±1)℃的透明玻璃桶(15 cm×20 cm)内被迫游泳6 min，每结束一次实验，换水。摄像头录制该测试视频并由实验者双盲离线分析后4 min内小鼠的不动时间。

2 结果

2.1 p-CA改善OBX诱导小鼠抑郁样行为Fig 1结果显示，在FST中(Fig 1B)，与对照组相比，SHAM组小鼠不动时间差异无显著性(P>0.05)，而与SHAM组相比，OBX组小鼠不动时间明显增加(P<0.01)，此外，与OBX组相比，p-CA组小鼠不动时间明显降低(P<0.05)。在TST中(Fig 1C), 与对照组相比，SHAM组小鼠不动时间差异无显著性(P>0.05)，而与SHAM组相比，OBX组小鼠不动时间明显增加(P<0.05)，此外，与OBX组相比，p-CA组小鼠不动时间明显降低(P<0.05)。在OFT中(Fig 1A)，与对照组相比，SHAM组小鼠移动距离差异无显著性(P>0.05)，而与SHAM组相比，OBX组小鼠移动距离明显增加(P<0.01)，此外，与OBX组相比，p-CA组小鼠移动距离明显降低(P<0.01)。这些结果表明，p-CA能有效改善小鼠抑郁样行为。

Fig 1 Effect of p-CA on depression-like behaviors of OBX mice n=9)

2.2 NBQX阻断了p-CA对 OBX小鼠抑郁样行为的改善作用Fig 2结果显示，在FST中(Fig 2B)，与OBX组相比，OBX+NBQX组小鼠不动时间差异无显著性(P>0.05)而OBX+ p-CA组小鼠不动时间明显减少(P<0.05)；此外，与OBX+ p-CA组相比，OBX+ NBQX+ p-CA组小鼠不动时间明显增加(P<0.05)。在TST中(Fig 2C)，与OBX组相比，OBX+NBQX组小鼠不动时间差异无显著性(P>0.05)而OBX+ p-CA组小鼠不动时间明显减少(P<0.05)；此外，与OBX+ p-CA组相比，OBX+ NBQX+ p-CA组小鼠不动时间明显增加(P<0.05)。在OFT中(Fig 2A)，与OBX+ Vehicle组相比，OBX+NBQX组小鼠移动距离差异无显著性(P>0.05)而OBX+ p-CA组小鼠移动距离明显减少(P<0.01)；此外，与OBX+ p-CA组相比，OBX+ NBQX+ p-CA组小鼠移动距离明显增加(P<0.05)。以上提示，NBQX能对抗p-CA对小鼠抑郁样行为改善作用。

Fig 2 Effect of NBQX on p-CA improved depression-like behaviors of OBX mice n=9)

如Fig 3所示，在FST中(Fig 3B)，与OBX组相比，OBX+CX546组小鼠不动时间差异无显著性(P>0.05)而OBX+ p-CA组小鼠不动时间明显减少(P<0.05)；此外，与OBX+ p-CA组相比，OBX+ CX546+ p-CA组小鼠不动时间明显降低(P<0.05)。在TST中(Fig 3C)，与OBX组相比，OBX+CX546组小鼠不动时间差异无显著性(P>0.05)，而OBX+ p-CA组小鼠不动时间明显减少(P<0.05)；此外，与OBX+ p-CA组相比，OBX+ CX546+ p-CA组小鼠不动时间明显增加(P<0.05)。在OFT中(Fig 3A)，与OBX+ Vehicle组相比，OBX+CX546组小鼠移动距离差异无显著性(P>0.05)而OBX+ p-CA组和OBX+ CX546+ p-CA组小鼠移动距离明显减少(分别为：P<0.05，P<0.01)；此外，与OBX+ p-CA组相比，OBX+ CX546+ p-CA组小鼠移动距离差异无显著性(P>0.05)。以上表明，CX546促进了p-CA对小鼠抑郁样行为的改善作用。

Fig 3 Effect of CX546 on p-CA improved depression-like behaviors of OBX n=9)

3 讨论

目前研究显示，OBX小鼠抑郁样行为增加，注射p-CA可改善OBX小鼠抑郁样行为,并且AMPA受体拮抗剂NBQX阻断了p-CA的抗抑郁样作用，而AMPA受体激动剂CX546增强了p-CA的抗抑郁样作用。

之前研究分别采用50mg·kg-1、75 mg·kg-1、100mg·kg-1的p-CA在一次LPS注射前24 h腹腔给药，并于LPS注射后2 h或6 h检测大鼠的抑郁样行为，结果显示50mg·kg-1和75mg·kg-1的p-CA对一次LPS注射诱导大鼠抑郁样行为具有预防作用[5]。为进一步验证p-CA对抑郁行为的治疗作用，进行了当前研究，OBX小鼠被注射75mg·kg-1的p-CA，连续注射3 d后检测小鼠的抑郁样行为。实验结果表明，p-CA慢性给药明显改善OBX小鼠FST和TST中小鼠抑郁样行为。此外，OBX小鼠常常出现激越行为，即旷场测试中活动度增加，这种激越行为是小鼠易激惹，应激敏感性增加的表现，这与抑郁症患者的敏感性相似。鉴于此，当前研究检测了对各组小鼠旷场测试中的活动度，结果显示与SHAM组小鼠相比，OBX小鼠OFT中活动度增加，而p-CA降低了这种活动度的增加。这些结果表明p-CA慢性给药可治疗OBX小鼠的抑郁样行为。之前研究表明，p-CA可改善小鼠氧化应激及脑缺血/再灌注损伤，改善东莨菪碱诱导大鼠被动回避和水迷宫测试中记忆障碍。当前研究进一步明确了p-CA对抑郁样行为的治疗作用，从而拓展了p-CA在中枢神经系统中发挥的神经保护作用。

嗅球切除是一种经典的啮齿类抑郁模型，OBX小鼠表现出识别记忆、恐惧记忆和空间记忆障碍，绝望、快感缺失等抑郁样行为，此外还具有高活动度、睡眠障碍、高攻击性等异常行为[12-13]。此外，其可导致皮层和海马神经元退化和死亡，体积萎缩，突触棘密度减少，突触可塑性降低[14]。 嗅球切除抑郁模型与一次LPS注射诱导的抑郁模型相比在表面效度和预测效度上更具优势。嗅球切除抑郁模型抑郁样行为可持续终生，而一次LPS注射诱导的小鼠抑郁样行为一般持续1-2 d。在评估药物抗抑郁作用方面，嗅球切除抑郁模型可进行急性或慢性给药，而一次LPS注射诱导的抑郁模型，只能进行急性给药，无法评价药物慢性给药的作用。此外，鉴于一些抗炎药物也可以改善LPS注射诱导的抑郁模型的抑郁样行为，因此这种模型并无法排除一些不具有抗抑郁作用的抗炎药物。并且LPS抑郁模型小鼠往往伴随其他的炎症引起的疾病行为，如体温升高，活动度降低，摄食摄水减少等。

AMPA受体与突触可塑性密切相关，并参与多种药物的抗抑郁样作用[3-4]。在慢性温和应激、慢性社会挫败等抑郁模型中均观察到脑中AMPA受体活性降低。一些抗抑郁药物可增加AMPA受体在突触的表达发挥抗抑郁样作用。并且AMPA受体拮抗剂NBQX可阻断抗抑郁药物的抗抑郁作用[15-16]。为明确AMPA受体是否介导了p-CA的抗抑郁样作用，本实验探索了AMPA受体拮抗剂NBQX和AMPA受体激动剂CX546分别对p-CA的抗抑郁样作用的影响。结果显示当最后一次p-CA给药前30min注射AMPA受体拮抗剂NBQX时，AMPA受体拮抗剂NBQX单独给药不影响OBX小鼠抑郁样行为，而NBQX阻断了p-CA对OBX小鼠抑郁样行为的改善作用。这些结果表明p-CA改善OBX小鼠抑郁样行为可能依赖于AMPA受体。当最后一次p-CA给药前30min注射AMPA受体激动剂CX546时，AMPA受体激动剂CX546单独给药不影响OBX小鼠抑郁样行为，而CX546增强了p-CA对OBX小鼠抑郁样行为的改善作用。这些结果表明p-CA改善OBX小鼠抑郁样行为依赖于AMPA受体。p-CA可能通过PKA、钙调蛋白、ERK、mTOR等促进AMPA受体生成或磷酸化促进其迁移上膜的过程，最终促进突触区域AMPA受体功能的增强进而介导其抗抑郁样作用[17]。

综上，当前研究表明p-CA改善OBX小鼠抑郁样行为，并且其作用可能依赖于AMPA受体。然而当前研究，无法判断在嗅球切除抑郁模型及p-CA处理中AMPA受体是否发生改变。因此在将来的研究中应进一步检测海马、内侧前额叶皮层中AMPA受体蛋白的表达情况。