YTH基因家族在肝癌中的表达和预后价值

胡宽，姚磊，李娟妮

（中南大学湘雅医院1.肝脏外科2.病理科，湖南长沙410008）

肝癌是全球癌症相关死亡的最主要原因之一，其发病率和病死率均位居所有癌症类型的前列[1]。尽管近年来不断有针对肝癌的各类药物研发出来，但由于其极高的恶性程度与发病的隐匿性，大多数肝癌患者的临床结局依旧很差，只有不到30%的肝癌患者能接受手术治疗[2]。因此，探索新的诊断、预后标志物和分子靶点对于改善肝癌患者的生存具有重要价值。

RNA 甲基化的失调与癌症的发生和进展密切相关[3]。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）修饰作为最常见的RNA 甲基化调控手段近来受到了广泛的关注，有望成为新的抗癌治疗靶点[4]。YTH（YT521-B homology family）基因家族成员共有5 个，都能编码具有m6A 识别功能的阅读蛋白，因在结构上都拥有一段高度保守的YTH 结构域而得名。这5 名家族成员又进一步分为3 类：YTHDC1（YTH domain-containing 1）、YTHDC2（YTH domaincontaining 2）和YTHDF（YTH m6A-binding protein），其中YTHDF 包含YTHDF1-3。研究表明，YTH 基因家族成员与多种类型癌症的发生发展都存在相关性。例如，乳腺癌细胞中ALKBH5 的下调可导致乳腺癌干细胞数量减少，进而显著降低乳腺癌的成瘤能力[5]。此外，敲低YTHDF2 的表达导致了胰腺癌细胞的侵袭性增加。又有报道表明在鼻咽癌中，YTHDC2 可以通过激活Akt 信号通路来促进肿瘤细胞的放疗抵抗[6]。然而，目前尚未有关于YTH 基因家族在肝癌发生发展中的表达和功能的系统研究。

本研究旨在通过多种公共数据库进一步拓宽对YTH 基因家族在肝癌中作用的理解，从而为肝癌的诊断和治疗提供新的视角。本研究评估了肝癌中各个YTH 基因家族成员的表达情况、预后价值、功能及通路富集分析，并讨论了肿瘤免疫细胞浸润与YTH 家族的相关性。

1 资料与方法

1.1 ULCAN和GEPIA2

ULCAN 是TCGA 和GTEx 数据来源的综合表达分析数据库[7]。通过ULCAN 分析肝癌和正常肝组织中各YTH 家族成员的表达差异，并分析其表达与临床TNM 分期和肿瘤分级的关系。GEPIA2 数据库[8]用于分析YTH 家族分子之间的相关性。P<0.05为有统计学意义。

1.2 Kaplan-Meier plotter

Kaplan-Meier plotter 数据库用于评估特定基因表达水平在癌症中的预后作用[9]。本研究通过该数据库分别评估了各YTH 家族成员的表达与肝癌患者总生存期（overall survival，OS）、无复发生存期（recurrence free survival，RFS）的相关性。P<0.05 被认为具有统计学意义。

1.3 cBioPorta和Cytoscape

cBioPortal 是一个癌症基因组学数据库，提供不同类型癌症的基因组改变数据的下载和分析[10]。使用cBioPortal 分析包含了360 例肝癌患者的数据集（TCGA，Firehose Legacy）来探究YTH 家族的基因改变情况，并筛选肝癌中YTH 相关基因，共筛选出155 个YTH 相关基因，然后通过Cytoscape 软件生成蛋白相互作用网络图。

1.4 WebGestalt

WebGestalt 是一个综合性的在线工具，支持基因集富集分析和网络拓扑分析[11]。本研究通过该工具对YTH 的相关基因进行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析。

1.5 TIMER 2.0

Timer 2.0 是一个公共资源平台，提供各种癌症中免疫细胞浸润的综合分析[12]。本研究中，通过该平台的“免疫关联”模块以获得散点图，该散点图显示了YTH 家族蛋白的表达与不同类型浸润免疫细胞（CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、B 细胞、树突状细胞、巨噬细胞和中性粒细胞）之间的相关性。

2 结果

2.1 YTH基因家族在肝癌中的表达

通过UALCAN 数据库进行分析，发现肝癌组织中所有的YTH 基因家族成员的mRNA 表达与邻近正常组织相比均明显升高（图1A）。此外，肝癌中每个YTH 成员的表达丰度各不相同，结果显示：YTHDC2 的相对表达量在YTH 家族成员中最低，而YTHDF2 的表达量最高（图1B）。根据不同的TNM分期划分肝癌亚组，发现YTH 家族分子的表达在亚组间呈现一定的差异，结果表明YTHDC1、YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3 趋势相同，在1、2、3 期中其表达水平逐渐升高，但在4 期中表达下降，并与正常组织相比无差异（图2A）。进一步探究YTH 表达与肿瘤分级的相关性，发现了类似的趋势，即YTH 家族分子在肿瘤的1、2、3 级中其表达水平依次升高，但在4 级中表达下降（图2B）。上述结果提示：YTH 家族可能参与肝癌的肿瘤进程，终末期肝癌患者较差的全身状况可能参与YTH 家族分子表达水平的下降。

图1 YTH基因家族表达分析A：YTH家族各成员在肝癌及正常肝组织中的mRNA表达差异（ULCAN）；B：肝癌中YTH家族各成员的相对表达水平（GEPIA2）Figure 1 Analysis of the mRNA expression profiles of YTH familyA:Differences in mRNA expression profiles between HCC and normal liver tissue(ULCAN);B:The relative expression levels of individual YTH members in HCC(GEPIA2)

图2 YTH基因家族的表达与肝癌患者临床TNM分期及肿瘤分级的相关性（ULCAN）A：YTH家族各成员的表达与TNM分期的相关性分析；B：YTH家族各成员的表达与肿瘤分级的相关性分析Figure 2 The relationship between the mRNA expression of YTH family and clinical stage and tumor grade in HCC(ULCAN)A:Association of the mRNA expression of YTH family with clinical stage;B:Association of the mRNA expression of YTH family with tumor grade

2.2 YTH基因家族在肝癌患者预后中的作用

为了进一步评估YTH 家族在肝癌患者中的预后价值，通过Kaplan-Meier plotter 数据库分析了YTH 家族成员的表达与OS、RFS 之间的相关性。结果显示：YTHDF1（P<0.01）、YTHDF2（P<0.05）的高表达与肝癌患者较差的OS 显著相关；关于RFS 的结果显示：YTHDF1（P<0.001）、YTHDF2（P<0.05）的高表达与肝癌患者较差的RFS 显著相关，然后YTHDF3（P<0.01）的高表达与肝癌患者较好的RFS 相关（图3）。上述结果提示：YTHDF1和YTHDF2 的高表达均与患者更短的OS 和RFS 密切相关，是肝癌潜在的预后标志物。

图3 YTH基因家族与肝癌患者预后的关系（Kaplan-Meier plotter）A：YTH基因家族在肝癌患者中的OS曲线；B：YTH基因家族在肝癌患者中的RFS曲线Figure 3 The relationship between mRNA expression of YTH family and prognosis of HCC patients(Kaplan-Meier Plotter)A:The OS curves of YTH family in HCC patients;B:The RFS curves of YTH family in HCC patients

2.3 YTH基因家族在肝癌中的遗传学改变

通过TCGA 数据库和cBioPortal 工具，进一步分析肝癌中YTH 基因家族基因改变的频率和类型。如图4所示，YTHDF3 基因变异率为25%，是YTH家族中最高的。YTHDC1 基因变异率为7%，为YTH 家族中最低。其他家族成员的基因改变频率分别为18%（YTHDF1），11%（YTHDF2）和8%（YTHDC2）。在360 例肝癌患者/样本中，有187 例检测到YTH 成员的遗传变异，其总变异率为52%。另外，在遗传变异类型方面，YTH 家族成员的主要遗传变异类型包括：基因扩增、基因缺失、错义突变和截短突变等（图4A）。通过GEPIA2 数据库分析YTH 基因家族分子之间的相关性，结果显示：YTHDC1 和YTHDC2 之间，以及YTHDC1 和YTHDC3 之间关系较为密切（图4B）。

图4 YTH 基因家族在肝癌中的遗传学改变及家族成员之间相关性分析A：肝癌中各YTH 家族成员的基因改变频率（cBioPortal）；B：YTH家族各成员互相之间的相关性（GEPIA2）Figure 4 Genetic alterations and correlation analysis of YTH family in HCCA:Summary of alteration rates for YTH family in HCC(cBioPortal);B:Correlation between each YTH member in HCC(GEPIA2)

2.4 YTH基因家族相关分子的功能及通路富集分析

首先，通过cBioPortal 数据库鉴定出肝癌中与YTH 基因家族最密切相关的155 个基因，并利用Cytoscape 软件构建了蛋白互作网络图（PPI），结果显示：IGF1、PCK1、CYP2B6 和ESR1 与肝癌中YTH 家族的功能密切相关（图5A）。随后利用WebGestalt 数据库对155 个YTH 相关基因进行了GO功能富集分析，结果显示：YTH 相关基因功能主要涉及生物调节、能量代谢、应激反应、多细胞生物过程、生物定位及发育过程等环节。YTH 相关基因主要在以下细胞及细胞外成分中高度富集：细胞膜、细胞外间隙、囊泡、细胞核、内膜系统、膜封闭腔、细胞浆、含蛋白质复合物等等。在分子功能方面，蛋白质结合、离子结合、水解酶活性、核酸结合、分子转导活性、转移酶活性是富集度最高的（图5B）。此外，KEEG 信号通路富集分析结果显示：YTH 相关蛋白与以下通路密切相关：药物分解代谢、外源性刺激反应、激素代谢、固醇类代谢、脂代谢、小分子的分解过程以及有机酸的生物合成功能（图5C）。

图5 YTH 基因家族相关分子的功能及通路富集分析A：肝癌中155 个YTH 基因家族相关分子的蛋白相互作用网络图（cBioPortal，Cytoscape）；B：GO 功能富集分析预测与YTH 家族相关的生物过程、细胞成分、分子功能（WebGestalt）；C：KEGG通路富集分析预测与YTH家族相关的信号通路（WebGestalt）Figure 5 Predicted functions and pathways of the relevant molecules of YTH familyA:Protein-protein interaction(PPI)of the 55 co-expressed genes of YTH family in HCC(cBioPortal and Cytoscape);B:GO functional enrichment analysis of the relevant biological process,cellular components and molecular functions of YTH family(WebGestalt);C:KEGG pathway analysis of the relevant signal pathways of YTH family(WebGestalt)

2.5 YTH基因家族与肿瘤免疫细胞浸润的相关性

肿瘤中的免疫细胞浸润是肿瘤微环境不可或缺的组成部分，也是反映预后和淋巴转移状态的独立指标。通过TIMER 2.0 数据库分析肿瘤免疫细胞浸润与YTH 基因家族各成员之间的相关性。结果显示：YTH 基因家族成员与各类免疫浸润细胞的相关性是高度一致的，即所有家族成员的表达均与CD4+T 细胞、B 细胞、中性粒细胞和树突细胞的浸润呈显著性正相关，与巨噬细胞浸润呈负相关。除YTHDF3 外，其余4 个YTH 家族成员与CD8+T 细胞浸润呈正相关（图6）。以上数据表明YTH 基因家族可能因其YTH 结构域的高度保守性，在肝癌肿瘤免疫细胞浸润的机制中发挥重要的作用。

图6 TIMER 2.0数据库分析YTH基因家族与肿瘤免疫细胞浸润的相关性Figure 6 The correlation analysis between YTH family expression and immune cell infiltrations using TIMER2.0

3 讨论

YTH 基因家族成员作为重要的m6A 阅读蛋白，通过与含m6A 的mRNA 特异性结合来调控靶RNA甲基化[13-14]。RNA 甲基化是广泛参与人类各种生物过程的一种重要的转录后修饰过程[15-16]。近年来m6A RNA 甲基化研究不断揭示了其在各类癌症的发生和发展中的促进作用，继而逐渐成为肿瘤学研究和靶向药物开发的新方向[17]。因此YTH 基因家族在各类肿瘤的机制研究中具有巨大的潜在价值。已有研究[18]表明，YTHDF1 是肝细胞癌的致癌基因，其在肝癌患者中过度表达并且与不良预后相关，其作用机制可能是通过Snail 介导m6A 依赖性WNT/β-catenin 通路的激活而实现的。而YTH 家族的另一个分子YTHDF2 在肝癌中的作用则表现出矛盾的两面性，一方面它通过m6A 依赖性的方式作为致癌基因参与肝癌的进展，另一方面又被证明其通过EGFR 和ERK/MAPK 通路发挥抑癌作用[19]。在卵巢癌中，YTHDF1 明显高表达，并与较差的临床结果相关，YTHDF1 通过促进EIF3C 的m6A 修饰翻译在体内和体外加速卵巢癌的生长和转移[20]。在肺癌中，YTHDF2 的表达异常升高，可能通过磷酸戊糖途径诱导的5-磷酸核糖和NADPH 机制通路促进肿瘤细胞的增殖和生长[21]。而YTHDF1 则被证明可以促进非小细胞肺癌中癌细胞的增殖，但是其高表达与更好的预后和化疗敏感性相关，表明了YTHDF1 在肺癌机制研究中的复杂性[22]。以上研究从不同的角度证实了单个YTH 家族成员在不同肿瘤中的重要性。

从YTH 基因家族的整体角度出发，本研究首次系统分析了肝癌中各YTH 家族成员的表达、预后价值、免疫浸润和相关功能。首先初步探索了YTH 基因家族在肝癌中的表达谱系差异，发现5 个YTH 家族成员（YTHDC1、YTHDC2、YTHDF1、YTHDF2 和YTHDF3）的表达在肝癌中均显著升高，表明YTH 家族分子均有作为肝癌致癌基因的潜力。随后分析了YTH 家族分子的预后价值，并分析其预后价值是否与表达趋势相一致，结果显示：只有YTHDF1 和YTHDF2 的高表达都与较差的OS 和RFS 显著相关。YTHDC1、YTHDC2、YTHDF3 虽有在肝癌中表达较正常肝组织为高，但这种高表达在OS 或RFS 生存分析中并无意义。以上结果表明YTHDF1 和YTHDF2 是潜在的肝癌促癌基因，可作为潜在的预后分子和新的治疗靶点，从而改善肝癌患者的生存。后续还需更多的实验和临床研究来进一步探究YTHDF1 和YTHDF2 发挥促癌作用的具体机制，为其作为潜在的肝癌治疗的新靶点提供更确凿的依据。

YTH 家族成员在各类肿瘤（特别是肝癌）中的相关研究结果显示：YTHDC2 的表达在肝癌组织中明显增加，并与肿瘤恶性程度呈正相关[23]。另一报道则提出YTHDF1 在肝癌中高表达，并与较差的临床结局相关[24]。此外，有研究[25]发现YTHDF2参与METTL3 介导的SOCS2 转录后沉默，从而在肝癌中发挥促癌作用。上述其他各团队的研究结论与本课题的结论相一致。但也有文献[26]提出了YTHDC2 作为肝癌抑癌基因的相反结论，意味着YTHDC2 参与调控肝癌机制的复杂性和异质性。YTH 家族分子也参与了很多其他类型癌症的进展，例如YTHDC2 可以通过m6A 修饰促进肺癌细胞中6PGD mRNA 的翻译。YTHDC2 通过缺氧/HIF-1α/Twist1 信号通路在结直肠癌转移中发挥促癌[27]。因此，YTH 基因家族（特别是YTHDF1、YTHDF2）在肝癌中的作用机制值得进一步深入的探索。

本研究通过对筛选的肝癌中与YTH 家族相关的基因进行功能和通路富集分析，进一步拓宽了我们对YTH 家族在肝癌发生发展过程中作用的认识。YTH 家族的主要功能指向代谢及生物合成及分解功能的调节，尤其是激素代谢、固醇类代谢、脂代谢、药物分解代谢等，而肝脏是人体最重要的代谢器官，上述分析结果提示：YTH 家族的表达异常可能通过代谢相关通路的改变参与肝癌进程。另外，近年来很多报道发现m6A 甲基化在肿瘤免疫中发挥着重要的作用。肿瘤中免疫细胞浸润谱可以作为新的生物标志物，从而有效改善多种癌症的诊断和预后[28-29]。本研究发现：在肝癌中多数YTH 家族成员的表达与CD4+T 细胞、CD8+T细胞、B 细胞、中性粒细胞以及树突细胞的浸润呈显著正相关，与巨噬细胞浸润呈显著负相关。据文献[30]报道：CD4+T 细胞、CD8+T 细胞、树突细胞通常被认为通过免疫反应抑制癌症进展，但各种免疫逃避机制可能导致上述免疫细胞虽然能够大量浸润入肿瘤，却无法发挥免疫抗癌功能，反而通过正反馈机制进一步加剧了免疫细胞的浸润。上述研究结论部分解释了本研究的发现，提示YTH 家族成员（尤其是YTHDF1、YTHDF2）的异常表达可能通过某种特定机制改变肝癌中免疫细胞浸润的构成比，从而影响临床结果和免疫治疗的疗效。本研究后续拟通过体外及体内实验进一步探究YTHDF1 和YTHDF2 在肝癌免疫调节中所发挥的具体作用，为临床肝癌患者新治疗方案的发现提供更多的理论依据。

综上所述，本研究发现YTH 基因家族在肝癌中异常高表达，YTH 家族成员（尤其是YTHDF1、YTHDF2）是潜在的预后标志物和新的治疗靶点，进一步的深入研究将促使更多肝癌患者的生存受益。