慢性乙型肝炎患者肝内TCR文库在核苷(酸)类似物治疗前后的变化及意义

吴宏楷 邓浩辉 龚明星 高洪波 王战会 于乐成

核苷(酸)类似物(nucleoside/nucleotide analogues，NUCs)是目前慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者的主要抗病毒治疗药物[1]，但HBeAg阳性CHB患者在NUCs连续治疗2～3年后，大约只有20%～30%的患者得以实现HBeAg血清学转换[2-3]。对CHB患者的研究发现，恩替卡韦(ETV)和替比夫定(LdT)等NUCs治疗可以有效抑制病毒复制，改善肝脏炎症[1]；对外周血单个核细胞(PBMC)的研究表明，NUCs治疗可部分恢复T细胞的免疫功能[4-6]。

T细胞通过其表面抗原识别受体(T cell receptor，TCR)识别抗原表位，实现T细胞激活和克隆增殖。TCR互补决定区3(complementarity determining region，CDR3)由V、D、J三个基因片段共同编码而成，可以特异性结合抗原肽，具有高度多样性，形成了庞大的TCR文库[7]。我们前期通过对CHB患者NUCs治疗前后外周血中TCR文库的动态研究，发现T细胞克隆变化与HBeAg血清学转换相关[5, 8]，提示T细胞对于CHB患者NUCs治疗应答有着重要作用。但是，外周血中T淋巴细胞仅为全身T细胞总数的2%～2.5%[9]，不能完全代表肝脏内T细胞的组成和变化[10-11]。同时，在肝癌患者的研究中发现，肝内T细胞可以更加精准地反映局部T细胞免疫应答[12]， 并且在多种肿瘤中已经证实，受局部微环境影响的肿瘤浸润T细胞可以更好地辅助肿瘤评估[13]。但是目前缺少对于CHB患者肝内TCR文库的研究，也无NUCs治疗前后肝内TCR文库动态变化的分析，为此我们对这一问题进行了研究。既往对CHB患者LdT和ETV治疗前后外周血中TCR文库的动态研究显示，不同NUCs治疗前后外周血中TCR文库均有类似变化趋势[5, 8]。本研究拟进一步对NUCs治疗前后肝组织中TCR文库的动态变化进行观察。因暂缺ETV、替诺福韦酯(TDF)和丙酚替诺福韦(TAF)治疗前后的肝穿刺组织，故以经LdT治疗的CHB患者的肝活检组织进行研究。

资料与方法

一、一般资料

本研究共纳入10例CHB患者，均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》[14]诊断标准，满足HBsAg持续阳性至少6个月； HBV DNA>100 000拷贝/mL；12个月内未接受过干扰素或NUCs抗病毒治疗，排除合并感染丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒或人免疫缺陷病毒。所有患者均完成104周基于LdT的抗病毒治疗方案，其中部分患者在36周加用阿德福韦酯(ADV)。

根据治疗104周HBeAg状态以及HBV DNA定量，将患者分为2组，每组各5例。HBeAg转换组(seroconversion，SR组)是指治疗104周发生HBeAg血清学转换且HBV DNA<300 拷贝/mL；HBeAg非转换组(non seroconversion，NSR组)是指治疗104周时HBV DNA下降但HBeAg持续阳性。

二、肝组织RNA提取与TCR文库构建

每例患者于治疗基线及治疗104周分别行肝穿刺活检并收集标本，用TRIzol法提取组织中总RNA，通过cDNA 5′末端快速扩增技术(5′RACE)逆转录TCRβ链基因全长序列，并进行巢式PCR扩增(Advantage 2 Polymerase Mix)，产物经QIAquick试剂盒纯化后用Illumina HiSeq3000平台进行高通量测序。

三、质控与数据对比分析

高通量测序数据经过滤，结合miXCR软件及IMGT/HighV-QUEST数据库进行综合分析。

四、统计学方法

所有统计学分析均采用SPSS 20.0软件进行。符合正态分布的参数使用平均数±标准差表示，不符合正态分布的参数使用中位数和四分位数或患者的数量(%)表示。SR和NSR两样本比较采用两独立样本 Wilcoxon秩和检验，配对样本用Wlicoxon符号秩检验，双变量相关分析采用Spearman秩相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、患者一般资料

两组患者基线时年龄(24 比 25)、HBV DNA(7.56 比 8.22 log10拷贝/mL)、HBsAg(3.32 比 4.80 log10IU/mL )、HBeAg(3.05 比 3.48 log10 S/CO)、ALT(151.0 比 208.0 IU/mL)、AST(108.0 比 78.0 IU/mL)、肌酸激酶(102.0 比 125.0 U/L)、肝脏硬度扫描、肝穿刺刺病理G-S评分差异均无统计学意义。

二、TCR克隆数鉴定与计数

10例患者基线及104周肝穿刺组织所测TCRβ序列经过滤，共获得5 000 547条序列，平均每例标本250 027条，此测序深度，保证了转录水平很低的T细胞也可检测到。经数据库比对，基线和104周分别获得了1 502 079和2 289 752条有效的TCRβ序列，总共鉴定到52种TRBV基因、13种TRBJ基因、790种不同的VJ组合、3 440种不重复CDR3的核苷酸序列以及3 111种不重复CDR3氨基酸类型。

进一步分析两时间点V基因、J基因的使用频率变化，TRBV6-5、TRBV5-6、TRBV12-4、TRBV10-2变化具有统计学意义，均为基线频率高于104周。对应TRBJ基因，仅有TRBJ2-6基线频率高于104周。

三、TCR文库多样性分析

从TCR文库的不重复VJ组合、CDR3克隆型、以及标准化香农熵(normalized Shannon diversity entropy，NSDE)三个方面，分析不同时间点患者肝内TCR文库多样性情况。其中，NSDE取值范围为0-1；取值接近于1，提示文库多样性越高，反之则越低。

患者基线时的不重复VJ组合数量高于104周(125.5 比 73.0，P=0.032，图1A)，将患者根据治疗结局分组后可发现，SR组基线时不重复克隆型数量高于104周(151.0 比 71.0，P=0.043，图1B)。与不重复VJ组合结果类似，患者基线时CDR3克隆型数量高于104周(195.0 比 122.5，P=0.059，图1D)，其中SR组两时间点数量差异具有统计学意义(223.0 比 109.0，P=0.043，图1E)。10例患者基线平均NSDE高于104周(0.55 比 0.29，P=0.047，图1G)，分组后可见SR组所有患者NSDE均呈现下降趋势(0.58 比 0.17，P=0.043，图1H)。提示经过治疗，大部分患者肝内TCR文库多样性下降，SR组下降趋势尤为显著。

图1 两时间点(基线和治疗104周时)肝组织TCR文库的多样性变化

四、TCR克隆动态变化

对比两个时间点CDR3克隆型的动态变化，将基线未检测到但104周可检测到的克隆称为新增克隆型，将基线可以检测到但104周未检测到的克隆称之为消失克隆型。两种变化克隆型数量较少，只予以分析基因频率(某类克隆型数量在两时间点不重复克隆型总数量的占比)。在SR组中，消失克隆型百分比多于新增克隆型(27.29% 比 67.89%，P=0.007，图2A)，而NSR组中两种类型克隆数量差异无统计学意义。

图2 两组患者肝内TCR不同克隆型(新增克隆型和消失克隆型)基因频率的比较

五、临床血清学指标与TCR多样性分析

根据基线和治疗104周两时间点TCR克隆类型变化，识别消失克隆与新增克隆，两种类型克隆数较少，不纳入分析，但是对比这两种克隆类型在每个患者总克隆类型的百分比，可以发现，SR组从基线到104周HBsAg的变化程度与消失克隆型变化呈正相关(r=0.9，P=0.037，图3)，NSR组未发现两者具有相关性。结果提示，SR组患者基线到104周消失克隆型的比例越高，HBsAg水平下降幅度越大。

图3 血清HBsAg水平与肝内TCR消失克隆型频率的线性相关图

讨 论

我们使用无偏倚的5′RACE技术对CHB患者NUCs(LdT)治疗过程中肝内TCR文库的动态变化进行了分析，发现肝内TCR文库高频使用的V基因与我们前期调查的CHB患者外周血中V基因结果并不完全一致[5, 8]，可能的原因是患者个体间V、J使用偏好的影响[7]，以及外周血与肝内T细胞组成存在差异[11, 15]。

经NUCs治疗，肝内TCR文库在不重复VJ组合、CDR3克隆型和NSDE三个层面都表现出多样性下降，尤其在SR组，治疗后TCR文库多样性显著降低，这与CHB患者NUCs治疗过程中外周血中TCR动态变化研究结果类似；外周血中CD4+和CD8+T细胞亚群整体呈现多样性下降，并且在抗病毒治疗应答患者中下降更显著[5, 8]。但是，外周循环中的T细胞受机体多种器官和因素的影响，变化幅度更小，而肝内T细胞变化可更加准确地反映其在肝组织局部的动态变化。T细胞的免疫重建体现在从“耗竭”表型转变为“激活”表型[5, 16]，T细胞功能部分恢复[17]，进而发生克隆增殖[5, 18-19]。本研究SR组患者经NUCs治疗，肝内T细胞文库多样性下降明显，推测可能由于治疗后肝内HBV特异性或相关性T细胞发生克隆增生，而与HBV无关的T细胞克隆相对减少，因此SR组消失克隆型百分比更多，这些肝内增生的克隆是否为HBV特异性T细胞值得进一步研究。

针对CHB和肝硬化患者外周血的研究表明，经过NUCs治疗后，部分与HBV无关的CD8+T淋巴细胞群体会加重肝脏炎症，与不良预后相关[20]。对比本研究，发现SR组肝内消失克隆型比例增高，TCR文库多样性相对下降，与基线到治疗104周HBsAg水平下降幅度有正相关关系，而NSR组不具有该现象。这一结果再次提示，SR组患者肝内发生的T细胞克隆增殖与HBV有关，间接证明实现HBeAg血清学转换患者肝内增生的T细胞群体更可能是HBV特异性T细胞。

综上，本研究首次对NUCs治疗前后肝内TCR文库的动态变化进行了研究，发现NUCs治疗后肝内TCR文库变化主要表现在消失克隆型增加、整体多样性下降，提示肝内T细胞在NUCs治疗后的免疫重建中有重要意义。未来对于CHB患者的治疗中，使用NUCs抗病毒药物的同时，结合适当的免疫调节策略，可能更有利于病毒控制和患者预后。