乳牙与恒牙牙髓干细胞成血管能力的比较

黄小亚 郑雷蕾 李彩玉 刘东蓉 赵梓艺 胡赟

近年来利用牙源性干细胞再生牙髓进行了大量的研究，牙髓干细胞来源于牙髓，作为种子细胞运用于牙髓再生，具有天然的优势。根据发育时间不同，牙髓干细胞可分为乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth cells,SHED)[1]和恒牙牙髓干细胞(dental pulp stem cells,DPSCs)[2],尽管有大量关于牙髓干细胞的研究，但目前大多数的研究聚焦于牙髓干细胞一般生物学特性及矿化能力的研究[3-5]，对乳牙和恒牙牙髓干细胞成血管能力的研究报道相对较少[6]，两者成血管能力的差异未见报道。故本实验拟探究乳牙和恒牙牙髓干细胞成血管能力的差异，进而为牙髓再生的治疗方法提供实验依据及新思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

纳入2019 年4 月～2019 年12 月重庆医科大学附属口腔医院10 例5～10 岁健康儿童因乳牙滞留拔除的乳牙样本以及10 例15 岁以下健康青少年正畸治疗拔除的前磨牙样本。样本收集征得患者及家属知情同意并获得伦理委员会批准。

L-DMEM培养基(Hyclone，美国)；血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维生长因子(bFGF)(Pretech，美国)；胎牛血清(FBS)(Natocor，阿根廷)；CCK8试剂盒(同仁，日本)；Matrigel胶(BD，美国)；Trizol Reagent(Invitrogen，美国)；RT-PCR试剂盒(Promega，美国)；兔抗人CD31抗体(Abcam，英国)；兔抗人GAPDH抗体(CST，美国)；羊抗兔IgG抗体(上海碧云天)；超净工作台、细胞培养孵箱(Thermo，美国)；倒置相差显微镜(Nikon，日本)。

1.2 SHED、DPSCs的分离培养

无菌条件下分别取出各个牙齿的牙髓组织，用酶消化法(4 mg/ml中性蛋白酶和3 mg/mlI型胶原酶按1∶1比例混合)获取细胞常规原代培养，培养3 d半量换液，之后2～3 d换液1 次，当细胞生长达到70%～80%融合时，消化后传代培养至P3用于后续实验。

1.3 CCK-8检测SHED、DPSCs的增殖

采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)测定细胞生长曲线。取第3代SHED和DPSCs按2×104个/孔的密度接种于96 孔板中，L-DMEM培养液常规培养，每2 天换液1 次，按每日分7组，每组3 个复孔，每天同一时间取一组细胞加入10 μL的CCK-8溶液于37 ℃、5%CO2孵箱中避光孵育4 h后，用酶标仪测定在450 mm波长处的吸光度A450，记录连续测定7 d的结果。

1.4 划痕实验检测SHED、DPSCs的迁移

预先用Maker笔在6 孔板背面画线标记，取对数生长的P3代SHED和DPSCs消化后，按5×105个/孔的密度接种于6 孔板，细胞长满板底后，用200 μL的枪头制作直线划痕，吸弃培养液，用PBS洗去划痕产生的细胞碎片，加入含1%FBS的L-DMEM培养液，放入孵箱中培养，于0、12、24 h取出在倒置相差显微镜下拍照观察划痕愈合情况。

1.5 体外成血管诱导

选取对数期生长的P3代SHED、DPSCs，按1×105个/孔的密度接种于6 孔板中，常规培养液(L-DMEM培养基：1%双抗，10%FBS)培养24 h待细胞完全贴壁融合后，将培养液更换为成血管诱导液[L-DMEM培养基：10%FBS，1%双抗，10 μg/L碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，0.1 mg/L地塞米松，50 μg/L血管内皮生长因子(VEGF)，2 g/L牛血清白蛋白(BSA)]，2 d换液1 次。

1.6 Matrigel小管形成实验

将Matrigel胶置于4 ℃冰箱内过夜融化，移液枪头、96 孔板等置于-20 ℃冰箱内过夜预冷。在超净台中将96 孔板平放于冰盒中，每孔缓慢加入50 μL Matrigel胶，注意不能有气泡，将加好Matrigel胶的96 孔板放入37 ℃、5%CO2孵箱中孵育30 min。取SHED、DPSCs成血管诱导14 d的细胞消化离心后，重悬于成血管诱导液，以4×104个/孔的密度接种于上述96 孔板中，放入孵箱中培养，于2、4 h时取出在倒置相差显微镜下拍照观察小管形成情况。

1.7 RT-PCR检测CD31、VEGF、EphB4、EphrinB2、vWF mRNA的表达

引物由生工生物工程(上海)有限公司设计合成(表 1)，Primer blast验证引物质量。两种细胞成血管诱导培养5、7、14 d，Trizol试剂盒提取各组细胞总RNA后测定浓度,Promega GoScript反转录系统进行逆转录合成cDNA。采用SYBR Green试剂盒进行RT-PCR检测，反应体系20 μL，实时荧光定量 PCR 仪检测并记录数据。

表 1 RT-PCR引物序列表

1.8 Westem blot检测CD31蛋白的表达

两种细胞成血管诱导培养7、14 d，提取各组细胞总蛋白，BCA浓度试剂盒测蛋白浓度。上样后SDS-PAGE凝胶电泳分离,转蛋白至PVDF膜, 5%脱脂奶粉室温封闭2 h后加一抗CD31、GAPDH(1∶1 000稀释) 4 ℃摇床孵育过夜，TBST洗膜3 遍，二抗(1∶5 000稀释)室温孵育2 h，TBST洗膜3 遍，化学发光法显影。

1.9 统计学方法

2 结 果

2.1 SHED、DPSCs细胞形态观察

乳牙和恒牙来源的牙髓组织块培养3～7 d，可见成纤维样细胞从组织团块边缘爬出，10～14 d左右细胞达70%～80%融合。SHED和DPSCs传代培养至P3，镜下观察到，SHED生长呈放射状或涡旋状，多数为长梭形，少数为多角形；DPSCs形态多样，有梭形和多角形等形状(图 1)。

图 1 SHED、DPSCs细胞形态(×40)

2.2 SHED、DPSCs的生长曲线比较

CCK8结果显示，两种细胞接种后1～4 d稳定生长，从第5天开始进入对数生长期，无明显平台期。从第5天开始到第7天，SHED的A值显著高于DPSCs,差异具有统计学意义(P<0.05)，表明SHED的增殖能力强于DPSCs(图 2)。

图 2 SHED、DPSCs的增殖曲线

2.3 SHED、DPSCs的迁移能力比较

通过拍照比较两种细胞的迁移率，在12、24 h时可见SHED迁移率显著高于DPSCs(图 3)，表明SHED的迁移能力强于DPSCs。

图 3 SHED、DPSCs划痕实验结果(×40)

2.4 SHED、DPSCs体外成血管能力比较

将成血管诱导14 d的两种细胞接种于Matrigel基质胶上孵育2 h后，倒置相差显微镜下均可见细胞相互连接形成类血管样结构，4 h后细胞胞体开始收缩见类血管样结构逐渐开始瓦解，通过ImageJ半定量分析，诱导后的SHED形成的血管网眼数、节点数、节段数均高于诱导后的DPSCs(图 4)。

图 4 SHED、DPSCs诱导后的Matrigel小管形成验(×40)

2.5 成血管相关基因及蛋白的表达

RT-PCR结果表明，第5、7、14天SHED较DPSCs更高表达CD31、VEGF、EphB4(P<0.05)；第5天和第7天，EphrinB2在SHED中更高表达(P<0.05)；第14天，SHED较DPSCs更高表达vWF(P<0.05)(图 5)。WB结果显示，第7天和第14天SHED的CD31蛋白表达量均高于DPSCs，与基因表达趋势一致。

图 5 CD31、VEGF、EphB4、EphrinB2、vWF mRNA及CD31蛋白的表达

3 讨 论

年轻恒牙常因外伤、龋病和发育畸形等原因导致牙髓坏死或根尖周炎，传统的治疗方法为根尖诱导成形术或根尖屏障术，但两种方法均有一定的劣势，治疗后的患牙牙根停止发育，根管壁薄而脆，易出现再感染、根折和牙齿脱落等并发症[7]。随着组织工程与再生医学技术的发展，基于干细胞的牙髓再生有望再生受损的牙本质和功能性牙髓，恢复患牙的天然功能。组织工程三大要素即干细胞、支架和生长因子，此外血供也极其重要[8]。SHED和DPSCs起源于神经嵴细胞，具有间充质干细胞的自我更新、克隆形成及多向分化等特点[9]。同时SHED和DPSCs位于血管周围的生态位，一方面可以旁分泌多种血管生成调节蛋白，另一方面在特定微环境下可以分化成血管内皮细胞，从而促进血管生成[10]。

虽然SHED和DPSCs都来源于牙髓组织, 但在增殖速率、分化潜能、基因表达谱等方面存在诸多差异[4]。本课题组前期的实验研究发现SHED较DPSCs相比具有更强的成牙本质分化能力[11]，此外本实验也通过比较研究发现SHED的增殖和迁移能力均强于DPSCs，与以往研究报道一致[3]，造成这种差异的原因可能是因为SHED相比DPSCs是更不成熟的间充质干细胞[12]。SHED良好的增殖、迁移和成牙本质分化能力为促进受损牙髓组织的修复和再生提供了保障。

牙髓组织的再生主要包含神经、血管、牙本质的再生，牙髓干细胞具有促进血管生成的作用，是一种运用于牙髓再生的优秀种子细胞。有研究将人DPSCs接种于牙薄片或支架上，移植到免疫缺陷小鼠皮下组织，用免疫组化和免疫荧光观察到人DPSCs分化血管内皮细胞并形成与小鼠血管吻合的新生血管[6]，类似地将人自体SHED聚合体植入牙髓坏死的年轻恒切牙空根管中观察到牙根继续发育和三维全牙髓再生，组织学染色显示再生的牙髓类似天然牙髓，含有神经、血管、成牙本质细胞、结缔组织等成分[13]，说明两种细胞参与血运重建，能有效促进血管新生，但它们成血管能力的比较未见报道。血管内皮细胞具有在基质胶上形成类血管样结构的独特能力，Matrigel基质胶可作为细胞增殖和迁移的支架，已被广泛应用于检测体外血管生成的实验中[14]。本研究通过Matrigel小管形成实验观察到经成血管诱导14 d后两种细胞均能在基质胶上形成广泛的类血管样结构，且SHED呈现出更明显的类血管样结构，表明了SHED较DPSCs具有更强的体外成血管能力。vWF是由血管内皮细胞合成的一种多聚糖蛋白，存储在其特异性细胞器(Weibel-Palade body，W-P)中，可作为鉴定血管内皮细胞的表面标志物[15]，目前研究中常用的成血管相关因子还有CD31、VEGF、EphrinB2、EphB4。本研究的PCR和WB结果表明，SHED成血管相关基因和蛋白的表达相对高于DPSCs，提示SHED经诱导后在分子水平上更接近血管内皮细胞，从而具有更强的成血管能力。

EphrinB2主要存在于动脉内皮细胞和壁细胞，而EphB4主要存在于静脉内皮细胞[16]。已有研究报道，剪切应力和VEGF可以诱导SHED内皮分化，当沉默EphrinB2时SHED在基质胶上形成类血管样结构的能力受到抑制，提示EphrinB2 信号通路可能参与SHED的内皮分化过程[17]。EphrinB2是一种Eph受体的跨膜配体，能够传导早期血管生成重构所需的细胞信号，有研究报道EphrinB2/EphB4受体信号通路在胚胎血管发育中发挥关键作用[18]，但EphrinB2调控血管系统发育和功能的分子机制目前尚不清楚。

综上所述，本研究证明了两种牙髓组织来源干细胞均能在体外诱导分化为血管内皮细胞，且SHED相比DPSCs表现出更强的增殖、迁移和成血管能力，但SHED成血管的能力仍需体内实验进一步验证以及成血管相关分子机制将在后续实验中深入研究。此外SHED具有来源丰富、取材容易、伦理争议小及免疫原性低等优点，使SHED运用于牙髓再生治疗中具有广阔前景。