miR-93通过调节Bax/Bcl-2的表达活性对胃癌细胞增殖、迁移及凋亡的影响

李光曙，寇继光，钟碧波，周中银，周锐

胃癌(gastric cancer)是常见的消化道恶性肿瘤之一，全球胃癌死亡率在全部恶性肿瘤中位居第二位[1]。虽然临床上的治疗方法的进展使胃癌发病率和死亡率的趋势有所降低，但由于缺乏早期诊断，低资源地区的发病率和死亡率仍然很高[2]。微小RNA(miRNA)是一组具有18个核苷酸序列的非蛋白质编码RNA，其通过与靶mRNA的3′突变区域中的互补序列结合来调节基因表达，从而影响转录后抑制和mRNA降解[3]。miRNA在细胞生长、分化过程中发挥重要作用，对人类多种癌细胞的增殖、侵袭及转移产生影响[4]。研究发现，miR-93过表达能够促进骨肉瘤细胞[5]、鼻咽癌细胞[6]、食管癌细胞[7]的增殖，miR-93过表达还与胆管癌的发生、发展密切相关[8]。提示 miR-93在癌症中发挥着癌基因的作用。Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 assaciated X protein, Bax)是一种促细胞凋亡蛋白，一般情况下，Bax表达水平越高，则更加有利于促进细胞凋亡的发生，而B淋巴细胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2, Bcl-2)是一种抗细胞凋亡蛋白[9]。当Bax和Bcl-2比例改变时，可以调节细胞凋亡情况，当Bcl-2过表达时，细胞具有抗凋亡作用；相反，当Bax占优势时，细胞易发生凋亡[10]。因此，本课题将研究miR-93是否调节Bax/Bcl-2的表达活性对胃癌细胞增殖、迁移与凋亡产生影响，进一步探讨其作用机制，为临床上治疗胃癌提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人正常胃细胞GES-1细胞系和胃癌细胞SGC-7901细胞系购自上海癌症研究所(中国)。DMEM培养基、RPMI-1640培养基、胎牛血清(FBS)和TRIzol试剂均购自美国Gibco公司。逆转录试剂盒购自Promega公司。TB GreenTMPremix Ex Taq II试剂盒购自TaKaRa公司。RIPA裂解液购自北京索莱宝公司。Bax、Bcl-2和GAPDH多克隆抗体和山羊抗兔IgG二抗购自美国Cell Signaling Technology公司。miR-93-inhibitor、及miR-93阴性对照由Genepharma(中国上海)合成。LipofectamineTM2000购自上海吉玛公司。Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自南京Vazyme公司。PVDF膜购自Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 GES-1细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基、SGC-7901细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，置于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，传代时用0.25%胰蛋白酶进行消化，一般2 d更换一次培养基，以保证细胞所需的营养成分。

1.2.2 细胞转染 SGC-7901细胞以1×105个/孔接种于24孔板，将细胞随机分为3组：①对照组(control组)：空脂质体转染组；②miR-93-NC组：转染100 nmol/L的阴性对照质粒; ③miR-93-inhibitor组：转染100 nmol/L的miR-93-inhibitor质粒，每组设3个复孔。待细胞生长汇合率至60%左右时，按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书进行。各组细胞在37 ℃、5% CO2的培养箱中培养6 h后，更换新鲜的培养基继续培养。48 h后结束培养，收集各组细胞进行后续实验。

1.2.3 克隆形成实验 转染48 h后的各组细胞以1×103个/孔接种于60 mm的细胞培养皿中。15 d后，用结晶紫染色溶液染色细胞，并计数含有≥50个细胞的集落，用奥林巴斯荧光倒置显微镜拍摄代表性集落并统计。实验独立重复3次。

1.2.4 细胞划痕实验 转染后的各组细胞融合度达到90%时，用200 μL无菌枪头沿培养皿底做直线划痕，形成间隙。PBS重复洗3遍，加入不含血清的培养基，放入培养箱中培养。48 h后在奥林巴斯荧光倒置显微镜下观察细胞愈合程度并拍照，测量细胞间的划痕距离。实验独立重复3次。

1.2.5 细胞凋亡实验 转染48 h后的各组细胞用冷的PBS清洗两次，然后在结合缓冲液中重悬并稀释至每1 mL液体中含1×105个细胞。严格按照Annexin V-FITC/PI 凋亡检测试剂盒说明书进行操作，用流式细胞仪进行细胞凋亡率的检测。实验独立重复3次。

1.2.6 qPCR 使用TRIzol试剂提取各组细胞的总RNA，用Nanodrop 2000仪器检测样品RNA浓度。然后按照反转录试剂盒说明书将总RNA反转录成cDNA。按照qPCR试剂盒说明书配置相应的体系，每组设置3个复孔。使用TB GreenTMPremix Ex Taq Ⅱ试剂盒进行qPCR。qPCR的条件如下：95 ℃ 30 s (1循环)，95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s(40循环)。使用StepOnePlus仪器完成实验后，采用2-ΔΔCt法分析数据。实验独立重复3次。其中使用的引物见表1。

表1 引物序列

1.2.7 Western blot

转染48 h后的各组细胞用蛋白酶抑制剂裂解液裂解细胞后提取蛋白，用BCA法测定总蛋白含量。取等量蛋白质样品上样，SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质后转膜，用5%脱脂奶粉封闭1 h，之后加入稀释后的Bax、Bcl-2、GAPDH一抗，4 ℃摇床上孵育过夜。用TBST洗膜3次，每次10 mim，加入对应于一抗种属来源的HRP标记的二抗，在室温摇床上孵育1 h，用TBST洗膜3次，每次10 min。使用ECL化学发光液显色发光，凝胶成像系统拍照，Image Pro Plus图像分析系统对蛋白条带进行分析

1.2.8 Caspase-3活性检测

转染48 h后各组细胞在冷的PBS中洗涤两次。用BD Cytofix/CytopermTM溶液重悬细胞，并在冰上孵育20 min。弃去BD Cytofix/CytopermTM溶液，并用1×BD Perm/WashTM缓冲液在室温下洗涤细胞两次。将细胞重悬于上述缓冲液中，并在室温下与抗体一起温育30 min。洗涤细胞，重悬于0.5 mL 1×BD Perm/WashTM缓冲液中，使其含有1×106个细胞，然后通过流式细胞术分析。实验独立重复3次。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 miR-93在GES-1细胞和SGC-7901细胞中的表达水平

应用qPCR法检测 miR-93在GES-1细胞和SGC-7901细胞中的表达水平，如图1所示，与GES-1细胞组比较，在SGC-7901细胞中miR-93表达水平显著上调(P<0.01)。

2.2 miR-93对SGC-7901细胞增殖、迁移的影响

克隆形成实验结果显示，与control组和miR-93-NC组相比，miR-93-inhibitor组SGC-7901细胞增殖能力下降(P<0.01，P<0.05)(图2A，2C)；细胞划痕实验结果表明，与control组和miR-93-NC组相比，miR-93-inhibitor组SGC-7901细胞迁移能力下降(P<0.01，P<0.05)(图2B，2D)。以上实验数据表明miR-93抑制胃癌细胞的增殖与迁移。

图1 miR-93在GES-1和SGC-7901细胞中的表达水平(与GES-1组比较，**P<0.01)

2.3 miR-93对SGC-7901细胞凋亡的影响

细胞凋亡实验显示：与control组和miR-93-NC组相比，miR-93-inhibitor组SGC-7901细胞凋亡能力增强(P<0.01)，以上实验数据表明miR-93促进胃癌细胞的凋亡。见图3。

图3 miR-93对SGC-7901细胞凋亡的情况 与control组比较，***P<0.001；与miR-93-NC组比较，###P<0.001

2.4 miR-93对SGC-7901细胞中Bax/Bcl-2表达的影响

qPCR和Western blot结果显示：与control组和miR-93-NC组相比，miR-93-inhibitor组SGC-7901细胞中Bax mRNA和蛋白的表达上调(P<0.01)，Bcl-2 mRNA和蛋白的表达下调，且Bax/Bcl-2的比例上调(P<0.001)。以上实验数据表明miR-93能通过调节Bax/Bcl-2的表达活性促进胃癌细胞的凋亡。见图4。

图4 miR-93对SGC-7901细胞中Bax/Bcl-2的表达情况 A:miR-93对SGC-7901细胞中Bax/Bcl-2 mRNA的表达情况;B:miR-93对SGC-7901细胞中Bax/Bcl-2蛋白的表达情况。与control组比较，**P<0.01， ***P<0.001；与miR-93-NC组比较，##P<0.01，###P<0.001

2.5 miR-93对SGC-7901细胞中Caspase-3活性的影响

Caspase-3活性实验结果表明：与control组和miR-93-NC组相比，miR-93-inhibitor组SGC-7901细胞中Caspase-3的活性提高。以上实验数据表明miR-93能通过体影响Caspase-3活性促进胃癌细胞的凋亡。见图5。

图5 miR-93对SGC-7901细胞中Caspase-3活性的影响 与control组比较，***P<0.001；与miR-93-NC组比较，##P<0.01

3 讨论

胃癌(gastric cancer,GC)是全球癌症相关死亡的主要原因，东亚占年度病例的一半以上[11]，而我国是GC高发国家之一，每年GC的新发病例和死亡病例约占全球的42.6%和45.0%[12]。对于局部GC患者，手术仍然是基本治疗方法，然而即使接受了外科手术治疗，5年生存率仍低于30%[13]。此外，大多数患者被诊断为GC晚期，此时不再进行根治性手术，并且现有治疗方案的结果仍不令人满意[14]。超过一半的晚期GC患者发现转移，并导致大多数癌症相关死亡[15]。因此，找到胃癌的综合治疗模式，以提高其生存率是多年来的研究热点。

miR-93位于染色体7q22的宿主基因Mcm7的第13位[16]。已经报道了miR-93在几种类型的癌症中的异常表达，例如乳腺癌、子宫内膜癌和肝细胞癌[17-19]。以前的研究表明，miR-93可以作为致癌基因的癌基因，可以加速肿瘤的生长、侵袭和血管生成。但也有报道认为miR-93抑制卵巢癌细胞中的肿瘤发生[20]。相反的结论可能归因于miR-93在分化程度和癌症类型中发挥特定功能的事实。此外，显示miR-93也参与胃癌的发生或发展[21]。然而，miR-93的生物学功能和分子机制在胃癌中尚不清楚。

Bcl-2家族蛋白是细胞凋亡与存活的一个重要控制器，凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax均属于Bcl-2家族，是两种标志性的凋亡蛋白[22]，促凋亡蛋白Bax与抑凋亡蛋白Bcl-2间形成同源二聚体或异源二聚体，分别起抑制或促进凋亡的作用[23]。Bax/Bcl-2的比率是启动细胞凋亡的关键因素，当两者之间的比率上调时，可导致细胞凋亡，当两者之间的比率下调时，可使细胞凋亡受到抑制[24]。Bcl-2可以抑制Caspase-3的激活和合成，从而抑制细胞的凋亡，破坏细胞增殖与凋亡的平衡，导致肿瘤发生[25]。因此，Bax/Bcl-2的表达活性影响细胞的凋亡情况。

本实验中我们先确定了miR-93在胃癌中的表达情况，qPCR结果显示，与人正常胃细胞组相比，胃癌细胞中miR-93表达水平显著上调(P<0.01)，与上述文献报道一致。为了研究miR-93是否对胃癌细胞的增殖、迁移与凋亡产生影响，进行了如下实验：克隆形成实验结果显示，与control组和miR-93-NC组相比，miR-93-inhibitor组SGC-7901细胞增殖能力下降(P<0.01，P<0.05))；细胞划痕实验结果表明，与control组和miR-93-NC组相比，miR-93-inhibitor组SGC-7901细胞迁移能力下降(P<0.01，P<0.05)；细胞凋亡实验显示：与control组和miR-93-NC组相比，miR-93-inhibitor组SGC-7901细胞凋亡能力增强(P<0.01)。进一步探讨了miR-93与Bax/Bcl-2表达活性的关系，qPCR和Western blot结果显示：与control组和miR-93-NC组相比，miR-93-inhibitor组SGC-7901细胞中Bax mRNA和蛋白的表达上调(P<0.01)，Bcl-2 mRNA和蛋白的表达下调，且Bax/Bcl-2的比例上调(P<0.001)。之后测定了Caspase-3活性，结果表明：与control组和miR-93-NC组相比，miR-93-inhibitor组SGC-7901细胞中Caspase-3的活性提高。因此，miR-93通过调节Bax/Bcl-2的表达来抑制进胃癌细胞的增殖、迁移，促进胃癌细胞的凋亡。

综上所述，miR-93在胃癌细胞中高表达，下调miR-93的表达能抑制胃癌细胞株的增殖、迁移，促进胃癌细胞的凋亡，并通过调节Bax、Bcl-2、Caspsae-3的表达活性促进细胞凋亡，其可能的机制与Bax/Bcl-2的表达活性调控有关。