不可逆电穿孔对不同分化结肠癌细胞杀伤作用的实验研究

2021-08-10李夏西陈泽敏胡威黄思霖龚伟

现代消化及介入诊疗 2021年6期

李夏西，陈泽敏，胡威，黄思霖，龚伟

结肠癌是发病率第三的恶性肿瘤，全世界2020年有190万新病例，93万人死亡[1-2]。国内流行病学研究显示，结肠癌的发病率持续升高[3-4]，很多患者诊断时已经发生远处转移，5年生存率低于10%[5-6]，且近年来发病年龄呈现年轻化趋势[7]。对于结肠癌，手术和化疗是首选的治疗方式，但创伤大[8]。近年来出现很多新型治疗如靶向治疗、基因治疗[9-10]以及各类治疗方法联合[11]。特别是内镜技术结合消融技术为结肠癌的治疗开发了新方向。

基于非热效应杀伤细胞的不可逆电穿孔(irreversible electroporation, IRE)是一种新兴的肿瘤消融技术。近年来以纳米刀(nanoknife)治疗仪的形式被引入治疗不能实施手术的实体肿瘤和局部晚期癌症，包括前列腺癌、肾癌、肝癌、骨癌和胰腺癌等靠近重要结构的癌灶，且已展现出良好的治疗和生存改善效果[12-15]。然而目前IRE对结肠肿瘤有效治疗的报道仍较少，其作用机制也不甚清楚。因此，本研究旨在通过探讨IRE对不同分化程度结肠肿瘤细胞株增殖的抑制作用，考察IRE对结肠肿瘤治疗的有效性，期望未来能为将IRE技术常规应用于治疗结肠肿瘤提供可靠证据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

实验选取结肠癌低分化细胞株HCT116，中分化细胞株SW480和SW620，高分化细胞株LoVo。癌细胞培养基：内含10%胎牛血清(fetal clf srum, FBS)，100 U/mL青霉素(penicillin, P)、100 μg/mL链霉素(streptomycin, S)的DMEM培养基；KYSE-150培养基：45% RPMI-1640+45% Ham’s F-12+10% FBS+1% P/S；KYSE-410培养基：90% RPMI-1640+10% FBS+1%P/S。以上所有细胞均为贴壁生长，于37℃、CO2培养箱内常规培养。

1.2 不可逆电击实验及细胞活性检测

取对数生长期的结肠癌细胞，用0.25% Trypsin-EDTA消化后重悬于培养基中。用血球计数板进行计数，将细胞种植在平行板电极间距为2 mm的电击杯(620 electroporation cuvettes，美国Harvard Apparatus公司)，置于安全操作池(BTX, 美国Harvard Apparatus公司)中，连接生物医疗脉冲发生器BPG 300(苏州泰思特公司)，根据所设置的电场参数(表1)进行电击实验。随后种至96孔板，分别设置空白组(仅加培养基)、对照组(0 V/cm对应的不进行IRE处理的细胞)、实验组(分别经各组参数电击后的细胞)。每组设置6个复孔，每孔约8000～10000个细胞，放回培养箱内继续培养24 h后，每孔加入10 μL MTT溶液，将96孔板放回培养箱继续培养3 h，去掉上清液，每孔加入100 μL的DMSO，摇床100 rpm摇匀5 min，酶标仪测定在570 nm处的OD值，计算脉冲电场刺激下的细胞存活率，绘制细胞增殖曲线。

根据文献[16-20]报道，本实验需要的参数为4个：脉冲频率(Hz)、脉冲电场强度(V/cm)、脉冲宽度(μs)及脉冲个数(个)。

参数具体选取为：脉冲频率固定为1 Hz，脉冲电场强度为0～2 000 V/cm(选取参数为0、500、1 000、1 500、2 000 V/cm)；脉冲宽度为0～100 μs(选取参数为25、50、75、10μs)；脉冲个数为0～100个(选取参数为1、10、20、40、80个)；。每次实验分别从脉冲频率、脉冲宽度、脉冲个数、电场强度选1个参数进行实验。

2 结果

2.1 不同参数下低分化结肠癌细胞的增殖结果

MTT细胞增殖实验显示，当电场强度达到1 500 V/cm，脉冲个数达到40个，不同脉宽作用均可明显抑制HCT116细胞的增殖(图1)，显示低分化HCT116细胞对于IRE具有较高的敏感性。

图1 不同脉冲参数IRE对低分化结肠癌细胞株HCT116生存率的影响

2.2 不同参数下中分化结肠癌细胞的增殖结果

与IRE对于HCT116细胞的作用类似，在高场强(>1 500 V/cm)和高脉冲个数(>40个)的作用下，不同脉宽均可对SW620和SW480细胞的增殖产生显著抑制作用(图2和图3)，显示IRE对于中分化结肠癌细胞也具有良好的抑制效果。

图2 不同脉冲参数IRE对中分化结肠癌细胞株SW480生存率的影响

图3 不同脉冲参数IRE对中分化结肠癌细胞株SW620生存率的影响

2.3 不同参数下高分化结肠癌细胞的增殖结果

与前三株细胞相比，不同参数的IRE对LoVo细胞增殖的影响明显减弱。在高场强(>1 500 V/cm)和高脉冲个数(>40个)的作用下，LoVo细胞的增殖亦未受到明显抑制(图4)，提示该细胞对IRE作用具有较高的耐受性。同时实验结果也表明，IRE对于分化程度不同的结肠癌细胞的增殖具有选择性，表现为对于中等分化和低分化的结肠癌细胞具有显著的抑制作用，对于高分化结肠癌细胞的增殖抑制作用不明显。

图4 不同脉冲参数IRE对中分化结肠癌细胞株LoVo生存率的影终诱导细胞凋亡程序启动，导致细胞死亡。本研究中，我们通过体外实验证实IRE对不同分化程度的结肠癌细胞株具有不可逆的杀伤作用，其杀伤作用因结肠癌的分化程度不同而具有选择性，IRE电场强度达到1 500 V/cm，脉冲个数高于40时，可明显抑制中低分化结肠癌细胞株的增殖，对于高分化结肠癌细胞株LoVo细胞增殖的影响明显减弱。高分化结肠癌细胞的增殖抑制相对中等分化和低分化的结肠癌细胞来说，可能需要更强电场强度或频率等参数。当前，内镜治疗操作难度相对较大，且存在出血、穿孔等严重并发症风险。我们的研究结果可为今后研发适用于消化道系统的IRE治疗仪，应用于消化道早癌内镜下治疗提供实验依据。