不同年龄段不孕女性成熟卵母细胞冷冻复苏效果的影响因素分析

牛子儒 王 洋 陶立元 郑晓英 严 杰 李 蓉

北京大学第三医院(100191)

80年代早期国外学者开始应用冷冻解冻后人成熟卵母细胞进行体外受精-胚胎移植(IVF)并使患者成功受孕[1]。随着辅助生殖技术的广泛开展及细胞冷冻、低温保存技术的不断改进，冻融卵母细胞的复苏率、受精率和妊娠率都有了显著提高。美国生殖医学学会也于2013年提出“人成熟卵母细胞冷冻技术可以广泛应用于临床”[2]。但目前卵母细胞冷冻技术在我国尚未广泛开展，仅限于取卵日男方获取精子失败而进行的“应急性卵母细胞冷冻”，对于可能影响卵细胞复苏的因素尚不十分明确。年龄是影响女性生育力的重要因素[3]，随着年龄的增加，卵细胞的数量和质量均显著下降[4]。年龄对人成熟卵母细胞解冻复苏效果的影响，以及不同年龄段人群冷冻卵母细胞复苏效果的影响因素是否存在差异等相关研究鲜有报道。本研究回顾性分析因男方原因行应急性卵母细胞冷冻保存的临床资料，探讨不同年龄段女性卵母细胞解冻复苏的影响因素，为临床决策提供建议。

1 对象与方法

1.1 对象与分组

回顾性分析2007年8月-2019年12月在本院实施IVF助孕，取卵日因男方获取精子失败而接受应急性成熟卵母细胞玻璃化冷冻的不孕症患者临床资料。其中男方因素获取精子失败包括因突发疾病或意外事故不能到医院取精、不能进行手淫或手术[经皮附睾精子抽吸术(PESA)和显微附睾精子抽吸术(MESA)]取精、未能获得足够的精子，以及其他意外精子收集失败。排除女方因恶性肿瘤、卵巢储备功能下降等因素而行生育力保存的患者。根据卵母细胞解冻后是否存活分为存活组(2003例)和未存活组(688例)，并按年龄分层为<35岁组(2297例)和≥35岁组(394例)。所有患者行成熟卵母细胞玻璃化冻融、胚胎培养和移植前均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1促排卵与卵母细胞玻璃化冷冻解冻均按照本院常规操作进行[5]。 复苏培养后，观察卵母细胞膜完整、胞质均匀有光泽者视为存活[6]。

1.2.2分析指标包括临床病史、内分泌和胚胎实验室相关数据：女方年龄、体质量指数(BMI)、不孕年限、妊娠次数、生产次数、不孕类型(原发/继发性不孕)、IVF助孕指征(男方因素，女方因素或双方因素)、基础性激素水平、窦卵泡数(AFC)、促性腺激素(Gn)应用总剂量及时间，卵母细胞冻存时间和是否存在子宫内膜异位症(EM)等疾病[7]。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 一般资料

共有251例不孕患者2691枚成熟卵母细胞纳入本研究，卵母细胞解冻复苏存活率为74.4%(2003/2691)，解冻存活组年龄(29.1±4.6岁)小于未存活组的年龄(30.2±5.0岁)(P<0.001)。

2.2 <35岁女性卵母细胞冻融复苏效果的影响因素分析

解冻存活组的年龄、生产次数，基础FSH水平和Gn用量均低于未存活组，而AFC高于未存活组(P<0.05)，且解冻存活组EM和卵巢低反应的发生比例低于未存活组(均P<0.05)。见表1。将有统计学差异的变量纳入logistic回归模型，分析显示，女方年龄大(OR=0.94，95%CI 0.91～0.97)、罹患EM(OR=0.68，95%CI0.49～0.95)为卵母细胞解冻复苏的独立危险因素，而AFC多(OR=1.03，95%CI 1.01～1.04)为解冻复苏的独立保护因素。

2.3 ≥35岁组卵母细胞冻融复苏影响因素分析

解冻存活组女方年龄、妊娠次数、基础雌二醇(E2)和卵子冻存时间均低于未存活组，而不孕年限、生产次数和基础促黄体生成素(LH)均高于未存活组，且解冻存活组EM和继发不孕的发生比率低于未存活组(均P<0.05)。见表1。将有统计学差异的变量纳入logistic回归模型，分析显示，基础E2水平高(OR=0.98，95%CI 0.98～0.99)、冻存时间长(OR=0.98，95%CI 0.97～0.99)、罹患EM(OR=0.15，95%CI 0.06～0.36)和继发不孕(OR=0.22，95%CI 0.13～0.37)为解冻复苏的独立危险因素。

表1 不同年龄段卵母细胞解冻复苏影响因素的单因素分析

3 讨论

1999年，Kuleshova[8]报道了世界首例卵母细胞冷冻保存后成功妊娠分娩的病例，标志着卵母细胞冷冻保存技术的突破。目前，国内外关于冻融卵母细胞的研究主要集中在IVF结局影响因素的探究。一项纳入10个研究2265个卵母细胞冻融周期的meta分析提示，随着年龄的增长，解冻卵母细胞后的活产率明显下降[9]。国内一项有关卵母细胞玻璃化冷冻后ICSI妊娠结局的研究也提示女方年龄及成熟卵数对卵母细胞解冻的妊娠结局有重要影响[10]。大多数研究表明，冻融卵母细胞周期与新鲜取卵周期的妊娠结局无明显差异[11]。但冻融损伤可能会导致卵母细胞的细胞器、纺锤体、染色体和表观遗传学出现损伤或变化[12]。本文数据显示，近1/4的卵母细胞解冻后可能无法存活，女方年龄、卵巢储备功能、卵子冻存时间和罹患子宫内膜异位症等因素均会影响成熟卵母细胞玻璃化冷冻后的解冻复苏效果。

年龄是导致女性生育能力下降的重要因素，卵母细胞的数量和质量均随着年龄的增长而降低。女性35岁之后卵巢储备功能和卵母细胞质量明显下降，流产等不良妊娠结局的发生风险显著增加[3]。这可能与衰老伴随的分子生物学改变密不可分。衰老使女性生殖系统中的氧化磷酸化和腺苷三磷酸水平下降，辅酶Q10的利用率下降，进而导致线粒体功能受损[13]，引起卵母细胞质量下降。此外，不同年龄女性的成熟卵母细胞mRNA转录组的表达存在显著差异，这意味着非编码转录组可通过调节某些转录后翻译机制，影响卵母细胞的发育潜能[14]。本研究也提示女性年龄是影响卵母细胞解冻复苏后是否存活的重要因素，年龄越大，卵母细胞解冻复苏的成功率越低。

AFC是反应卵巢储备功能的重要指标之一[15-16]，对IVF结局有良好的预测价值。但受限于超声仪器的分辨率、监测标准和时间的不统一以及无法辨识出闭锁卵泡等因素[16]，AFC可能高估了对促排卵有反应的真实卵泡数。本研究提示AFC是影响年龄<35岁的患者卵母细胞解冻复苏效果的关键因素，这可能是由于AFC更能反应年轻患者的卵巢储备情况，间接体现了卵母细胞的质量。而对于高龄女性，AFC普遍偏少，其反应卵母细胞质量的可行性随之降低。

本研究提示，EM是唯一一个对两个年龄段女性卵母细胞复苏效果均有负面影响的关键因素。大量的研究已经证实，EM是导致女性不孕的重要因素之一，它通过抑制细胞内P450芳香化酶的表达、增加活性氧生成等作用改变卵泡内环境和颗粒细胞特征，通过减少皮质颗粒和导致透明带硬化，干扰受精、影响胚胎孵化和着床[17]。此外，EM还会造成卵细胞成熟障碍[18]、卵细胞质量下降和基因缺陷发生率明显增加[19]。患有EM者卵细胞冻融复苏效果明显下降可能与上述原因密切相关。后期可以对EM患者的卵母细胞进行更全面的基础分析，了解玻璃化冷冻过程对其的影响。

E2在调节卵母细胞成熟和胚胎着床等方面都起着关键作用，基础E2水平是评价卵巢储备功能的重要指标，在卵巢储备功能减退的患者中往往会先于卵泡刺激素(FSH)提前升高。随着卵巢储备功能的下降，卵泡期和黄体期的抑制素水平也明显下降，削弱了对FSH的抑制作用，使得FSH峰提前出现，导致卵泡提前募集，甚至在月经期出现直径10mm以上的卵泡，升高的E2进一步抑制FSH的分泌和释放,出现月经期基础FSH水平正常但E2水平升高的现象。基础E2升高(≥275.3pmol/L)往往预示着卵巢反应不良、高周期取消率和低胚胎种植率[20]。本研究表明，≥35岁组，随着基础E2水平的上升，卵母细胞解冻复苏的成功率明显下降。对于这部分人群，可以通过基础E2的水平预测卵母细胞解冻后复苏成功率。

冻存时间是否影响成熟卵母细胞的解冻复苏效果，不同的研究结果不一。Yan等[21]的研究提示，冻存时间越长，卵母细胞的解冻复苏率越低。而Stigliani等[22]的研究则表明冷冻本身会对卵母细胞造成损伤，但冻存时间的长短并不改变卵细胞的基因谱。本研究结果也提示，对年龄<35岁女性，冻存时间不影响卵母细胞的解冻复苏；而对于年龄≥35岁女性，随着冻存时间的延长，卵细胞的解冻存活率明显下降，这可能与高龄女性卵母细胞质量下降、冷冻和解冻过程进一步加速了卵母细胞的凋亡有关，但仍需要进一步的基础实验证实，以了解其分子水平的变化和机制。

综上所述，年龄是影响人成熟卵母细胞解冻复苏的关键因素，不同年龄段的女性，影响卵细胞冻融复苏的因素略有不同。35岁之前，随着年龄的增长、AFC的减少和EM的发生，卵母细胞解冻失败的风险明显增加。35岁之后，基础E2水平升高、冻存时间延长和EM等因素均是卵母细胞解冻失败的关键危险因素。