3 个柚类品种（系）抗寒性研究

陶爱群，姜小文

（湖南环境生物职业技术学院，湖南 衡阳 421005）

湖南地处亚热带南部，气候温暖湿润，适于柑橘的生长，是中国柑橘重要产地之一。柚（Citrus maxima）是芸香科柑橘属植物，其果实营养丰富，富含维生素C，耐储藏，有“天然罐头”的美誉。但湖南1 月骤然的降温、极端低温或周期性大冻害的袭击，常导致柚园发生冻害，影响柚树生长，继而影响柚果产量和品质。已有的柚类低温胁迫研究[1-3]结果表明，柚类越冬期耐寒性存在差异且受外源PP333 调控。为了解柚的抗寒性差异，笔者选取湖南广泛栽培的沙田柚、琯溪蜜柚与新品系泉口冰雪柚为试材，研究低温胁迫后相关生理指标的变化，以期为柚类抗寒育种提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料选衡阳县泉口村常规管理水平的柚园5年生沙田柚、琯溪蜜柚和泉口冰雪柚3 个品种，砧木均为酸柚。

1.2 试验方法

2018 年12 月下旬—2019 年2 月下旬，每月1 次从正常结果、树冠外围无病虫害的树体采取健康生长、长势基本一致的春梢上第三或第四片叶。将叶片带至实验室后，用直径为1 cm 的打孔器打出叶圆片，分别置于1、-1、-3、-5、-7、-9 和-11℃可调温冰箱中（温度波动±0.5℃）处理12 h 后取出备用,以不经低温处理的材料作对照。

用DDS-312 型精密电导仪测定电导率，参照章文才[4]的方法计算出相对电导率；MDA 含量、SOD活性的测定用氮蓝四唑（NBT）法；CAT、POD 活性测定参照李玲等[5]的方法。每个指标测定5 次，取平均值。

1.3 数据统计分析

采用Excel 2010 进行数据分析和作图。

1.3.1 细胞伤害率计算细胞伤害率按相对电导率计算即：细胞伤害率（%）=（R-CK）/（R0-CK）×100%，其中R为低温处理材料的电导率，R0为低温处理材料经煮沸后的电导率，CK 为对照的电导率。

1.3.2 半致死温度计算先转化细胞伤害率yi=ln[（k-y）/y]，将Logistic 方程y=（1+ae-et）转化为ln[（k-y）/y]=lna-bt，将细胞伤害率（yi）转变成与处理温度（t）的直线方程，通过一元回归方法求出方程参数a、b 值及相关系数R。半致死温度 LT50 即拐点温度t=lna/b。其中y为实测细胞伤害率，t 为冷冻处理温度，k 为细胞伤害率的饱和量（本研究中k=100）[5]。

2 结果与分析

2.1 低温处理对电导率的影响

2.1.1 低温处理对相对电导率的影响3 个柚品种的相对电导率均随着处理温度的下降而上升，变化曲线呈S 形，但上升幅度因品种而异（见表1）。当处理温度由1℃降至-3℃时，3 个品种的相对电导率均低于10%，尤其是泉口冰雪柚仅为5.2%，在此低温范围内，细胞膜虽因低温处理产生了一定的伤害，但影响不大；当处理温度由-3℃下降到-5℃时，3 个品种相对电导率的上升幅度开始增大，琯溪蜜柚的电导率由7.8%上升至19.4%，沙田柚由9.0%上升至25.5%，泉口冰雪柚由5.2%上升至11.2%；当处理温度由-5℃下降至-9℃时，3 个品种的相对电导率上升幅度进一步增大，琯溪蜜柚由19.4%上升至65.2%，沙田柚由25.5%上升至70.6%，泉口冰雪柚由11.2%上升至46.8%；而当处理温度由-9℃下降到-11℃时，琯溪蜜柚和沙田柚的相对电导率均呈下降趁势，分别由65.2%下降至60.3%和由70.6%下降至65.8%，而泉口冰雪柚的相对电导率仍继续上升，由46.8%上升至57.3%，但上升幅度有所减缓。

表1 不同低温处理对3 个柚品种相对电导率的影响 （%）

2.1.2 不同柚品种的半致死温度由于3 个柚品种的相对电导率变化趋势呈S 曲线，可以利用Logistic曲线方程进行拟合，3 个柚品种的拟合值系数均大于0.978 8，呈极显著水平。琯溪蜜柚、沙田柚和泉口冰雪柚的半致死温度分别为-8.70、-8.04 和-9.66℃（见表2）。植物半致死温度的高低能反映植物对低温的耐受能力。因此3 个柚品种的抗寒能力由弱到强依次为沙田柚、琯溪蜜柚和泉口冰雪柚。

表2 Logistic 方程拟合方程参数及半致死温度

2.2 低温处理对MDA 含量的影响

MDA 是植物遭受低温胁迫后细胞膜膜脂过氧化形成的产物，其含量的高低代表细胞膜过氧化程度的大小。不同低温处理后3 个柚品种的MDA 含量均呈上升趋势，但增长幅度因品种而异（见表3），说明3 个柚品种经低温处理后细胞膜均会发生过氧化作用，但过氧化程度因品种而不同。在同一低温处理下，以泉口冰雪柚的MDA 含量最低，即在同一低温处理下泉口冰雪柚的膜脂过氧化程度低于琯溪蜜柚和沙田柚。

表3 不同低温处理后3 个柚品种的MDA 含量 （μmol/g）

2.3 低温处理对CAT、SOD、POD 含量的影响

植物在遭受冻害时体内会产生大量的自由基，导致自由基过氧化反应与自由基清除反应失去动态平衡而使植物产生冻害。植物的氧化系统如抗氧化保护酶主要包括氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）可抵御因低温胁迫产生的过氧化反应，因此测定抗氧化保护酶的活性可用来确定植物抗寒能力的大小[6]。

SOD 是植物细胞中清除自由基的酶之一，它能催化生物体内分子氧活化的中间产物超氧阴离子自由基（·）发生歧化反应，生成O2和H2O2，从而减轻（·）对植物体的毒害作用[7]，其活性高低是植物抗寒性的重要指标之一。由表4 可知，琯溪蜜柚和沙田柚的SOD 活性在-9～1℃的范围内均随着温度的下降而上升，当温度由-9℃下降到-11℃时则SOD活性下降，说明这2 个品种在-9～1℃的温度范围内，清除自由基的能力均呈上升趋势，但随着温度的继续下降，则酶活性降低，植物的细胞活性也下降。泉口冰雪柚的SOD 活性则随着温度的下降一直呈上升趋势，说明泉口冰雪柚的自由基清除能力随着温度的下降一直呈上升趋势。在温度为-3～1℃时，SOD 活性是琯溪蜜柚高于泉口冰雪柚，泉口冰雪柚高于沙田柚；而温度为-11～-3℃时，SOD 活性则是泉口冰雪柚高于琯溪蜜柚，琯溪蜜柚高于沙田柚。

表4 不同低温处理后3 个柚品种的SOD 活性 [μ/(mg·min)]

CAT 是植物体内清除H2O2的酶之一，也是植物应对低温的防御系统之一，是细胞彻底清除活性氧的关键酶，其活性大小与植物的抗寒性有一定关系。琯溪蜜柚和沙田柚的CAT 活性在-7～1℃范围内均随着温度的降低呈上升趋势，而当温度为-11～-7℃时则随着温度的降低而呈下降趋势；泉口冰雪柚的CAT 活性在温度为-9～1℃时随着温度的降低而上升，在-11～-9℃时随着温度的降低而下降；在同一低温下，CAT 活性是琯溪蜜柚高于泉口冰雪柚，泉口冰雪柚高于沙田柚（见表5）。

表5 不同低温处理后3 个柚品种的CAT 活性[μ/(mg·min)]

POD 是植物体内普遍存在的活性较高的一种酶，也是植物体内重要的保护酶之一，与CAT 一起分解由SOD 作用产生的H2O2，生成无害的水，其活性高低与植物的抗逆境能力密切相关。从表6 可知，琯溪蜜柚与沙田柚POD 活性在-7～1℃范围内均随着温度的降低而上升，而后随着温度的继续降低而呈下降趋势；泉口冰雪柚则是在-9～-1℃范围内随温度降低呈上升趋势，从-9 降至-11℃略有下降；在同一低温下，POD 活性表现为泉口冰雪柚高于琯溪蜜柚，琯溪蜜柚高于沙田柚。

表6 不同低温处理后3 个柚品种的POD 活性 [μ/(mg·min)]

3 小 结

柚的抗寒性高低可通过测定膜透性大小、游离脯胺酸含量、可溶性蛋白质、可溶性糖含量[8]等指标衡量，也可用半致死温度和田间表现等指标衡量[9]。该研究通过测定细胞膜的相对电导率和Logistic 方程拟合得出沙田柚、琯溪蜜柚和泉口冰雪柚的半致死温度分别为-8.04、-8.70 和-9.66℃，这种半致死温度的排序与3 个品种的田间表现一致。

该研究结果还表明：在同一低温处理下泉口冰雪柚的MDA 含量最低；温度为-11～-3℃时，SOD 活性是泉口冰雪柚高于琯溪蜜柚，琯溪蜜柚高于沙田柚；CAT 活性是琯溪蜜柚和沙田柚在温度为-11～-7℃时随着温度的降低呈下降趋势，而泉口冰雪柚则是当温度为-11～-9℃时才随着温度的降低而下降；琯溪蜜柚与沙田柚的POD 活性在-7～1℃范围内随着温度的降低而上升，而后随着温度的继续降低而呈下降趋势，泉口冰雪柚则是在-9～-1℃范围内随温度降低呈上升趋势，从-11～-9℃才略有下降，且在同一低温下，POD 活性表现为泉口冰雪柚高于琯溪蜜柚，琯溪蜜柚高于沙田柚；沙田柚的3 种酶活性在各低温处理下均低于琯溪蜜柚和沙田柚。因此，MDA 含量和SOD、CAT、POD 酶活性经低温处理后的变化也证明了泉口冰雪柚最抗寒，琯溪蜜柚居中，沙田柚最不抗寒。