牡丹江野生鹿血中伯氏疏螺旋体分子检测

于昕宇，胡 阳，樊佳鹏，邓小丽，王春仁，常巧呈

黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163000

伯氏疏螺旋体隶属于螺旋体目，螺旋体科，疏螺旋体属，病原通常呈单细胞疏松盘绕的左旋螺旋结构，是一类可寄生于哺乳动物各器官组织内的革兰氏阴性菌。其宿主动物主要分两大类：一类为小型的禽类、兽类及啮齿类动物，最为常见的是各种鼠类、兔子以及鸟类，是幼蜱和若蜱的供血宿主和病原储存宿主；另一类为大型的鹿科动物及家畜，常见的有鹿、马、牛、羊、犬等，是成蜱的主要供血宿主。伯氏疏螺旋体引起的疾病为“莱姆病”，该病在世界各地流行，在我国主要分布东北地区，给人类健康和畜牧业造成的经济损失十分巨大。本实验对牡丹江海林市野生鹿血携带伯氏疏螺旋体病原的情况进行分子流行病学调查，报道如下。

1 材料与方法

1.1 样品采集

2019年6月间，从我国牡丹江地区海林市采集20份野生鹿的血液样本，所有样本均为静脉采血，分别收集到含有抗凝剂管中并标记，置-20℃冰箱保存。

1.2 主要试剂

血液DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；DL-2 000 Marker、2×Tamaster Mix均购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.3 dNA提取

将采集到的血液，按照血液DNA提取试剂盒说明书提取DNA，并置-20℃冰箱保存，备用。

1.4 伯氏疏螺旋体基因序列的扩增

参考相关文献中的引物序列扩增鹿血液样本中的伯氏疏螺旋体5S-23SrDNA基因片段[1]。扩增目的片段的引物序列为：上游引物 5'-CGACCTTCTTCGCCTTAAAGC-3'和下游引物5'- TAAGCTGACTAATACTAATTACCC -3’。PCR扩增体系（总体积25 µL）：2xTap Master Mix(Dye Plus) 12.5 µL，上下游引物各0.5 µL，模板DNA1µL，dd H2O 10.5µL。PCR扩增程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，62℃退火1 min（每循环下降0.5℃），72℃延伸1 min，共38个循环；72℃再延伸7min。取PCR扩增产物，用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 伯氏疏螺旋体测序及进化分析

将检测出阳性的PCR扩增产物送往吉林库美生物工程股份有限公司进行测序。测序成功的序列经拼接后，使用CLC软件对所得完整序列进行分类。随后通过NCBI上的BLAST程序检索参照序列,应用MEGA6与相关病原进行进化性分析。

2 结果与分析

2.1 伯氏疏螺旋体5S-23SrDNA序列扩增

琼脂糖凝胶电泳检测结果显示5S-23SrDNA部分序列大小为412 bp左右（图1），与预期结果相符。

2.2 伯氏疏螺旋体5S-23SrDNA序列的进化及分析

本实验所获得的伯氏疏螺旋体测序结果比对分析可分为2个类型，分别是B.afzelii和B.garinii，其中B.afzelii型与德国分离得到的B.afzelii型CP018262.1在同一进化分支上，B.garinii型与法国分离到的B.garinii型 CP028861.1在同一进化分支上（见图2）。

图2 伯氏疏螺旋体阳性测定结果构建进化树

3 讨论

研究表明通过扩增伯氏疏螺旋体的核糖体5 S-23S基因之间的可变区，可以检测并鉴定出目前已发现的几乎所有伯氏疏螺旋体基因型。故本研究采用扩增伯氏疏螺旋体的5S-23SrDNA基因片段进行伯氏疏螺旋体的检测，结果显示在20份野生鹿血样本中，7份检出为伯氏疏螺旋体DNA片段，阳性率为35%。该检测结果提示牡丹江海林市地区存在较高的伯氏疏螺旋体的自然感染，为蜱传病原相关疾病的潜在疫原地，可能会对人群和家畜的健康产生潜在危害。

源性分析发现，6条阳性序列与法国分离到的B.garinii型CP028861.1在同一进化分支上，有1条与德国分离得到的B.afzelii型CP018262.1在同一进化分支上。由伯氏疏螺旋体引起的莱姆病于1975年在美国被首次描述和发现，伯氏疏螺旋体在我国主要分布在东北、华北和西北的林区，发病率高，临床表现复杂多样，该病原是一种严重威胁人类健康和畜牧业发展的蜱传疾病[2]。在全球范围内伯氏疏螺旋体至少有23个基因型[3]。在这些基因中已有研究发现至少有8种对人类有致病型[4]，其中包括本研究中发现的B.garinii和B. afzelii，与在牡丹江地区的景区检测到的基因型一致。而在被调查过的其他省份的景区中均未检测到伯氏疏螺旋体[5]。这也更加充分的表明了牡丹江地区是伯氏疏螺旋体重要的自然疫原地。

本次调查是首次在该地野生区动物鹿的血液中检测到伯氏疏螺旋体，该地区莱姆病的防控具有重要意义。