黑熊原熊与采胆熊血清抗氧化和肝功能指标的对比研究

张 亮，金红梅

吉林省龙井市智新镇综合服务中心，吉林龙井 133400

黑熊是大型兽类，在我国有较大地区分布，在延边地区是一项传统的特种养殖项目。熊胆是东北的一种特产，有较高的商业价值，市场上有很多戒酒保肝产品都采自黑熊胆。

本实验正是从熊血液分离血清中得到的一些抗氧化指标来进行采胆熊组和原熊组之间的对比，分析和研究血清中胆红素含量、超氧化物歧化酶活力等指标对黑熊养殖的影响和意义。

1 材料

1.1 试验动物

黑熊（延吉市白头山熊场）未经采胆手术的原熊，饲料中添加黄芪等中药的采胆熊，未经饲喂药物的对照采胆熊。

1.2 受试物及试剂

黑熊血清（延吉市白头山熊场），丙二醛、碱性磷酸酶等生理生化指标测定试剂盒（由南京建成生物工程研究所）。

1.3 试验设备

EASY pureⅡ 纯水仪、722S型分光光度计，电子天平、高速台式离心机。

2 方法

2.1 试验设计

24只成年黑熊，年龄相近，饲喂的饲料情况相同，健康状态相近，按采胆状况分为A、B、C三组，其中A组是在饲养食物中添加了黄芪等中草药的采胆熊，B组是未给药物的对照组采胆熊，C组为未经采胆手术过的原熊。分几天对这24只黑熊进行麻醉后采血。对采出的血液样品进行离心处理（2 500转/min），分离出血清。对得到的每个血清样本进行各项生理生化指标的测定，并对A,B,C三组的测定结果进行对比研究。

2.2 丙二醛（MDA）的测定

过氧化脂质降解产物中的丙二醛（MDA）可与硫代巴比妥酸（TBA）缩合，形成红色产物，在532 nm处有最大吸收峰（因底物为硫代巴比妥酸，所以此法称TBA法）。实验时设定四组测试管，分别为标准管、标准空白管、测定管、测定空白管。其中标准管中加入10 nmol/mL标准品0.06mL，测定管混合试剂2.4mL。标准空白管中加入0.06mL无水乙醇，测定管混合试剂2.4mL。测定管中加入0.06mL测试样品，2.4mL测定管混合试剂。测定空白管中加0.06mL测试样品，2.4mL对照管混合试剂。之后所有试管旋涡混匀器混匀，试管口用保鲜膜扎紧，用针头刺一小孔，95℃水浴40min，取出后流水冷却，532 nm处，1cm光径，蒸馏水调零，测各管吸光度值。

2.3 总胆红素的测定

重氮法。在强酸性介质中，血清中的胆红素可与工作液（由R1对氨基苯磺酸+盐酸+十二烷基三甲基氯化铵；R2亚硝酸钠；胆红素组成）混合后生成的重氮盐反应，形成红紫色的偶氮化合物。

实验时设定三组试管，即空白管、校准管、样品管。其中空白管中加入0.05mL生理盐水、1mL工作液，校准管中加入0.05mL校准品、1mL工作液，样品管中加入0.05mL样品、1mL工作液。混匀，在温度37℃保温10min，波长546 nm，比色杯光径1cm以空白管调零，分别读取吸光度，计算样品浓度。

理论计算公式：总胆红素浓度=（A样品/A标准）×C标准，标准浓度参考值为29.8g/L。

2.4 碱性磷酸酶（AKP）的测定

对硝基苯磷酸盐与水在碱性磷酸酶的作用下可生成对硝基苯酚和磷酸盐。

实验时首先制备工作液（由R1硝基苯磷酸盐；R2 2-氨基-2-甲基-1丙醇缓冲液和氯化镁组成）。设定两组试管空白管、样品管。其中空白管中加工作液1mL、蒸馏水0.02mL，样品管中加工作液1mL、样品0.02mL。混合均匀，在反应温度25℃、30℃、37℃保温60 s，读取初始吸光度，确定每分钟吸光度变化△A。

计算AKP（U/L）=(△A样品/分-△A空白/分)×F

F=Vt/（Vs×消化系数）×1000=2757，Vt=反应总体积，Vs=样品体积。

3 统计分析

数据用x±s表示,用软件EXCEL进行分析，0.01＜T＜0.05或T＜0.01表示差异显著及极显著。

所测定的4项指标，按生理作用可分为三组进行对比研究，其中与肝功能血液有关的生理指标有总胆红素（TBIL）。与抗氧化性有关的血清指标有丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶(SOD)和碱性磷酸酶(AKP)。

3.1 A组给药采胆熊与B组对照采胆熊的对比结果

与抗氧化性和肝功能有关的血清指标

3.2 B组对照采胆熊与C组原熊的对比结果

与抗氧化性和肝功能有关的血清指标

3.3 A、B、C三组的对比结果

3.3.1 丙二醛MDA的对比情况：由表1和表2对比数据显示，可知A、B间比较差异显著。表2中B、C间比较，数据差异性不显著。

3.3.2 超氧化物歧化酶SOD的对比情况：由表1和表2数据显示，A、B间有显著差异，B、C比较则不显著。

3.3.3 碱性磷酸酶AKP的对比情况：由表1和表2对比数据显示，A、B比较和B、C比较都没有显著差异。

3.3.4 总胆红素TBIL的对比情况：由表1和表2对比数据显示，A、B间差异不显著和B、C比较都没有显著差异。

4 讨论

动物血液生化正常参考值为生物医学研究的重要参考指标，是临床医疗和科学研究的重要依据，它不仅对动物正常生理状态和饲养管理具有指导意义，而且是病理学、毒理学研究以及探讨发病机理等研究中动物选择的根据。本实验对黑熊血清中各项生理生化指标的测定为临床研究和黑熊熊胆的采集生产奠定了基础。本实验研究显示，加入黄芪等中药制剂的采胆熊与对照组比较，加入药物对采胆熊的肝功能指标没有检查出好的促进作用，可能是当时的采血时药物的功效还未表现出来或药物选择不当。

5 结论

本实验研究显示，采胆熊与原熊血液生化指标中丙二醛、超氧化物歧化酶呈显著差异。采胆熊饲喂过程中应慎重添加中草药，为今后黑熊的健康养殖、疾病诊断和预测积累了资料。