吐鲁番斗鸡与新罗曼鸡MAOA基因外显子区遗传多态分析
2021-08-06刘秀霞廖凯任艳廖和荣
刘秀霞，廖凯，任艳，廖和荣
(石河子大学，新疆 石河子 832000)
单胺氧化酶A(MAOA)是去甲肾上腺素(NE)、 5-羟色胺(5-HT)和多巴胺(DA)的降解酶单胺氧化酶的一个亚型，它参与5-羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺素的代谢，而这些神经递质异常与行为异常和许多精神障碍类疾病有关[1-5]。有研究表明，MAOA基因与攻击行为有着密切的联系[6-8]。攻击行为是一个复杂的机体活动, 不但与多种遗传因素的协调作用有关，还和环境因素以及环境与遗传之间互作相关。人们从基因、环境与行为等方面对MAOA多态性与早期环境对个体攻击行为带来的影响做了许多研究[9-11]。目前报道的MAOA基因多态主要有：启动子区域的单胺氧化酶A串联重复序列(MAOA-VNTR)[12]，MAOA-LPR低活性等位基因和MAOA-LPR高活性等位基因[13]，第8外显子MAOA-T941G单核苷酸多态[14]，第14外显子MAOA-C1409T多态性等。研究表明MAOA基因的功能多态性与个体的冲动，攻击和反社会行为有关。最早发现，人MAOA基因的第8外显子上936位基因C-T错义突变，导致了患者的行为异常[6]。随后又发现,MAOA-VNTR短等位基因更可能是个体发生暴力攻击的“危险基因”[9,15-16]。MAOA基因多态性与攻击行为的关系已是当前攻击行为的遗传基础研究热点之一。对人影响攻击行为相关基因的研究，已取得部分进展,但对于动物的研究还比较少。吐鲁番斗鸡好斗、骨骼粗壮、身体结实、战斗力强是研究攻击行为的良好素材[17]。因此，本试验根据已经发现的与人攻击行为相关的基因MAOA，对吐鲁番斗鸡攻击行为相关的基因的多态性进行研究，旨在找到与鸡争斗行为相关的基因，从而对动物攻击行为的遗传机制进行更进一步的研究。
1 材料与方法
1.1 试验动物
选用石河子大学试验站的新罗曼鸡71只，吐鲁番斗鸡保种场的斗鸡103只。鸡翅膀静脉采集血样2 mL(ACD抗凝剂)，采用酚-氯仿抽提方法提取基因组DNA，-20 ℃保存，备用。
1.2 主要试剂
TaqDNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸(dNTP)、琼脂糖、蛋白酶K购自于北京天根生物科技有限公司；PUC19DNA/MspⅠmakers购自上海生物工程公司；Tris饱和酚、丙烯酰胺(Acrylamide)、过硫酸铵(APS)、甲叉双丙烯酰胺(Bis-Acrylamide)、蛋白酶K(protein K)、Trise碱购自德国QIAGEN公司。
1.3 引物设计
根据GenBank登录号为NC_006088.5鸡单胺氧化酶A基因的DNA序列，利用软件Primer 5.0针对鸡MAOA基因的10个外显子设计10对引物，引物序列见表1(引物由上海生物工程技术服务有限公司合成)。
表1 MAOA基因扩增的引物序列
1.4 PCR产物的克隆与测序
取PCR产物 10 μL与上样缓冲液(98%甲酰胺、0.025%二甲苯 氰、2%甘油，0.01 mmol/L EDTA)10 μL混合，在 PCR仪上98 ℃变性10 min，迅速置于冰上冰浴 5 min。用12%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳12～14 h，根据电泳图谱鉴定基因型。分别取不同基因型个体的PCR产物，经纯化回收后连接到T载体上， 转化B121感受态细胞，以蓝斑为对照，挑取阳性重 组菌落，经相同的PCR反应条件鉴定后送上海生工生物工程技术服务有限公司进行双向测序。
1.5 统计分析
运用DNASTAR软件，进行基因型频率和基因频率检测、品种内的Hardy-weinberg平衡检测(X2适应性检验)、有效等位基因、杂合度、多态信息含量分析。
2 结果与分析
2.1 PCR产物扩增
PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶检测,均获得与目片段大小一致的产物,产物条带清晰且无杂带,稳定性和特异性好，可直接进行聚合酶链式反应-单链构象多态(PCR-SSCP)分析。
2.2 聚合酶链式反应-单链构象多态(PCR-SSCP)检测
对MAOA基因的10个外显子进行多态性检测,只在引物MAOA1、MAOA2、MAOA5、MAOA7扩增的片段检测到多态，其中引物MAOA1、MAOA5、MAOA7扩增位点NC_006088.5(25424-25662)、NC_006088.5(34980-35257)、NC_006088.5(38401-38613)在吐鲁番斗鸡和新罗曼鸡上均检测到多态，引物MAOA2的扩增位点为NC_006088.5 (30260-30535)只在吐鲁番斗鸡上检测到多态。NC_006088.5(25424-25662)经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测发现3种基因型:AA、AB、BB(见图1)。NC_006088.5 (30260-30535)经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测发现2种基因型:AA、AB(见图2)。NC_006088.5(34980-35257)经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测发现6种基因型:AA、BC、BB、AB、AC、CC(见图3)。NC_006088.5(38401-38613)经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测发现3种基因型:AA、BB、AB(见图4)。
图1 引物MAOA1的SSCP
图2 引物MAOA2的SSCP
图3 引物MAOA5的SSCP
图4 引物MAOA7的SSCP
2.3 测序分析
测序结果表明，MAOA1引物扩增片段的AB型在该片段第T25541C和 G25614T处有突变，BB型在T25541C处有突变见(见图5)。
图5 引物MAOA1扩增的片段不同基因型测序结果
MAOA2引物扩增片段的AB型在该片段第T30342C处有突变(见图6)。
图6 引物MAOA2扩增的片段不同基因型测序结果
MAOA5扩增片段的AA、AB、AC在T35186G处有突变，BB、BC在G35215T处有突变，BB、CC、BC、AC、AB在T35223C处有突变，CC、AC、BC在G35198A、G30489T和G30470T处有突变，CC、BC在G35199A处有突变，BB型在C35133T出现有突变。上述这些突变位点均为同义突变(见图7)。
图7 引物MAOA5扩增的片段不同基因型测序结果
2.4 吐鲁番斗鸡、新罗曼鸡两种鸡群各位点的遗传多态性检测结果
表2 NC_006088.5(25424-25662)、 NC_006088.5 (30260-30535)、 NC_006088.5(38401-38613)在不同鸡品种的基因型和基因频率
表3 NC_006088.5(34980-35257)在不同鸡品种的基因型和基因频率
对吐鲁番斗鸡和新罗曼鸡MAOA1、MAOA2、MAOA5和MAOA7引物扩增的基因位点的多态性参数进行分析，结果见表4。
表4 MAOA基因扩增在两种鸡群体中的遗传特性
吐鲁番斗鸡和新罗曼鸡群体在MAOA1引物扩增的基因位点NC_006088.5(25424-25662)存在两个等位基因，杂合度分别为0.449、0.456，多态信息含量分别为0.348、0.352(0.25 MAOA可调节中枢神经系统单胺类递质的水平，对个体的情绪、成瘾、冲动、攻击等起重要作用[18]。茆正洪等[19]的研究认为，MAOA基因rs1137070位点多态性与具有高冲动的反社会人格障碍相关。针对健康的受试者和有攻击行为的精神分裂症患者，通过磁共振 (MRI)研究功能MAOA基因多态性对脑组织结构和功能的影响发现，MAOA启动子区可变数目重复序列多态性的基因型对男性暴力和攻击行为的影响更显著[19-20]。本研究中的NC_006088.5(25424-25662)、NC_006088.5(34980-35257)、NC_006088.5(38401-38613)位点，在吐鲁番斗鸡和新罗曼鸡上均检测到多态，而NC_006088.5 (30260-30535) 位点只在吐鲁番斗鸡上检测到多态，说明NC_006088.5 (30260-30535) 多态性位点可能与斗鸡的攻击行为相关，后面将做更进一步的研究。 一般用多态信息含量来衡量基因片段的多态性。多态信息含量的高低关系到该位点的使用效率和可用性，在一个群体中，一个位点多态信息含量越高说明它的杂合子比例越高，提供的遗传信息也就越多，根据多态信息含量值一般分为高度多态性(PIC>0.5)、中度多态性(0.253 讨论
