陕西省屠宰生猪PCV2检测及其遗传变异分析

罗弼豪，徐浩，罗丽华，范昱鑫，杨卓霖，王月婷，季天润，康煜坤，韩雪英*，郭抗抗*

(1. 西北农林科技大学动物医学院，陕西 杨凌 712100；2. 深圳海关动植物检验检疫技术中心，广东 深圳 518045)

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)于1991年在加拿大被首次报道，它不仅是断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原，而且与猪皮炎与肾炎综合征、猪呼吸道综合征、增生性坏死性肺炎和先天性颤抖病及繁殖障碍综合征等有重要关联。2000年，由该病毒引发的相关猪病在我国首次报道[1]，现如今PCV2已在我国猪群中普遍流行并严重危害我国生猪养殖和贸易的发展[2]。因此，加强生猪猪群中PCV2尤其是其亚型的监测和防控显得尤为迫切。

PCV2为无囊膜的单股环状DNA病毒[3]，其病毒基因组全长1 767 bp，含11个开放阅读框(open reading frame，ORF)，以编码的Cap蛋白ORF2最为重要。Cap蛋白大小约27.8 ku，是介导PCV2进入宿主细胞的衣壳(结构)蛋白，同时也是PCV2全基因组中变异程度最高的蛋白。鉴于Cap蛋白的重要性和特殊性，ORF2毫无疑问成为了研究PCV2整个基因组变异的首要靶基因[4]。

为深入掌握陕西部分地区屠宰生猪PCV2的流行和遗传变异规律，本研究对2018—2019年采自陕西部分地区屠宰生猪的血液样品进行PCV2检测，对部分阳性样品ORF2基因进行扩增测序、序列比对及遗传变异分析，通过探讨上述地区PCV2毒株流行和遗传变异情况，进而为该地区PCV2感染的针对性防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集和来源

2018年10月—2019年3月，课题组共对陕西省咸阳和杨凌的生猪屠宰企业进行了15次采样(每次20份)，合计采集血样300份。血样猪源来自汉中、安康、商洛、铜川、宝鸡、咸阳和杨凌等地。

1.2 主要试剂

病毒基因组提取试剂盒由天根生化科技(北京)有限公司生产；2×TaqPCR MasterMix以及凝胶回收纯化试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；DNA Marker DL 2000购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 引物设计与合成

参照汤智慧等[5]设计血液样品PCV2检测用引物。上游引物PCV2-F：5′-GTGGTCTACATTTCCAGCAGTTF-3′；下游引物PCV2-R：5′-GCTCAAACCCCCGCTC-3′。

参照GenBank中PCV2分离株(AF381175.1)设计ORF2基因扩增用引物，上游引物PCV2-Cap-F：5′-TTAAGGGTTAAGTGGGGGGTCTTTA-3′；下游引物PCV2-Cap-R：5′-ATGACGTATCCAAGGAGGC-GTT-3′。引物合成由英淮捷基贸易有限公司完成。

1.4 病毒DNA提取

血样在-80 ℃与室温间反复冻融3次后，按试剂盒说明书提取病毒DNA，提取物-20 ℃保存。

1.5 样品PCR检测

以PCV2-F/R为引物，参照汤智慧等[5]的反应条件进行病毒PCR检测。

反应体系：上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL、2×TaqPCR MasterMix 10.0 μL、样品DNA模板1.0 μL、补足ddH2O至20 μL；

反应条件：95 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，40个循环；72 ℃ 10 min。

1.6 ORF2基因扩增

选取20份PCV2阳性检测血样，以PCV2-Cap-F/R为引物扩增ORF2基因，并按试剂盒说明书纯化回收相关反应产物。

反应体系：上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL、2×TaqPCR MasterMix 10.0 μL、样品DNA模板1.0 μL、补足ddH2O至20 μL。

反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32个循环；72 ℃ 10 min。纯化回收产物经载体连接、感受态转化、抗性培养和PCR验证后测序。

1.7 ORF2基因序列比对和遗传变异分析

对获得的ORF2基因进行序列比对和构建遗传进化树，以获知PCV2阳性样品中ORF2的同源性和遗传变异情况。序列比对用12株国内外PCV2参考毒株(GenBank)，见表1所示。

表1 猪圆环病毒2型ORF2基因序列分析所选参考毒株基因型及登录号

2 结果与分析

2.1 样品中PCV2的病原学检测

300份屠宰生猪血样经PCV2-F/R引物扩增后，有38份血样在332 bp处获得了特异性条带，与预期目的条带大小一致。部分血样病原学检测PCR结果见图1所示，PCV2病原学检测阳性率为12.67%(38/300)。

N. 阴性对照；P. 阳性对照；M. DNA Marker DL 1000；71～91. 部分屠宰生猪样品

2.2 部分PCV2阳性样品ORF2基因的扩增和测序

从38份PCV2阳性样品中选取20份(SX-HZ-P1、SX-HZ-P2、SX-AK-P1、SX-AK-P2、SX-BJ-P1、SX-BJ-P2、SX-BJ-P3、SX-BJ-P4、SX-SL-P1、SX-SL-P2、SX-SL-P3、SX-SL-P4、SX-YL-P1、SX-YL-P2、SX-YL-P3、SX-YL-P4、SX-YL-P5、SX-YL-P6、SX-YL-P7和SX-YL-P8)，以PCV2-Cap-F/R为引物扩增ORF2基因，均在大约750 bp附近获得了与预期大小一致的特异性条带，经测序验证，扩增产物均为ORF2基因，且产物大小为702 bp(图2)。

M. DNA Marker DL 2000；1. 阴性对照；2. 阳性对照；3～22. 20份阳性样品

2.3 ORF2基因的序列比对

20份扩增的ORF2基因间序列比对结果显示，核苷酸和编码氨基酸的同源性为94.3%～100%和85.9%～100%。它们与12株国内外PCV2参考毒株ORF2基因序列比对结果显示，核苷酸和编码氨基酸的同源性为89.5%～100%和79.5%～100%。其中，与SH1001(KF850459.1)和SH1102(KF850464.1)毒株ORF2基因的核苷酸和编码氨基酸同源性为95.0%～99.7%和88.5%～99.1%(图3)；与SXXAA-01(KC800644.1)和YN/KM/2018(MH593263.1)毒株ORF2基因的核苷酸和编码氨基酸同源性为94.6%～100%和87.6%～100%(图4)。

图3 ORF2基因核苷酸同源性比对结果

图4 ORF2基因氨基酸同源性比对结果

2.4 ORF2基因的遗传变异分析

20个扩增的ORF2基因构建的遗传进化树如图5所示。遗传变异分析的结果显示：11份阳性血样所含毒株属于PCV2b亚型(SX-HZ-P1、SX-HZ-P2、SX-AK-P1、SX-BJ-P1、SX-BJ-P4、SX-SL-P1、SX-SL-P2、SX-YL-P1、SX-YL-P2、SX-YL-P4和SX-YL-P6)，9份阳性血样所含毒株属于PCV2d亚型(SX-AK-P2、SX-BJ-P2、SX-BJ-P3、SX-SL-P3、SX-SL-P4、SX-YL-P3、SX-YL-P5、SX-YL-P7、SX-YL-P8)，PCV2b亚型和PCV2d亚型分别占55%和45%；未发现其他PCV2亚型。

图5 ORF2基因遗传进化树建立

3 讨论

PCV2自1991年报道以来就在全球广泛流行，其10%～30%的死亡率给世界养猪业造成极为严重的损失[6]。由于PCV2对养猪业带来严重的负面影响，因此，加强生猪PCV2的监测和防治，不仅有利于猪群养殖安全，也有利于保障人民的食用安全。为确保PCV2监测结果的代表性和有效性，猪源的选择至关重要。单纯选择不同地域分布和养殖规模的单一猪场开展PCV2监测，不利于从更高和更广的视角研究PCV2的发病和流行病学情况。生猪屠宰企业是某一区域生猪的主要集中地之一，在这里采集的样品能同时涵盖多个猪场，从而更有代表性，是开展地区生猪猪群PCV2监测的重要且有效途径。段群棚等[7]曾对2015年3月至2019年2月采集自广西14个地市规模猪场的1 114份具有呼吸道症状病猪样品进行疫病病原学检测，结果显示，PCV2的阳性率为38.96%；李新苹等[8]曾对新疆5个规模化屠宰场进行了猪支原体肺炎与其他病原混合感染情况的调查，结果显示，新疆猪支原体肺炎、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、PCV2或者胸膜肺炎放线杆菌(APP)的混合感染率为57.1%。本研究对2018—2019年采自陕西省咸阳和杨凌地区生猪屠宰企业的300份血样进行PCV2病原学检测，阳性率达到12.67%(38/300)，表明PCV2在陕西省生猪猪群中的存在不容忽视。与罗丽华等[9]对2016—2017年采自陕西省免疫猪场和非免疫猪场样品的PCV2病原学检测结果相比，虽然本试验PCV2的阳性结果(12.67%)显著低于非免疫猪场的PCV2阳性结果(32%)，但仍略高于免疫猪场10%的阳性结果，提示陕西省屠宰生猪猪群的PCV2防控依然任重道远，来源猪场需随时根据本地PCV2流行情况采取更加有针对性的生物安全措施。

考虑到ORF2基因是PCV2遗传变异分析时的常用靶基因[10-11]，为获得血液来源地区PCV2的遗传变异情况，本研究对20份PCV2阳性血液的ORF2基因进行了序列比对和遗传变异分析。结果显示，采集的陕西省屠宰生猪血样中PCV2毒株，与所选的12株国内外参考毒株尤其是疫苗株的ORF2基因具有高度同源性，如与国内KF850459.1和KF850464.1株ORF2核苷酸和编码氨基酸的同源性，分别达到了95.0%～99.7%和88.5%～99.1%；与KC800644.1和MH593263.1株ORF2核苷酸和码氨基酸的同源性分别达到了94.6%～100%和87.6%～100%。随后的遗传变异分析进一步揭示，11份阳性血样所含毒株属于PCV2b亚型，9份阳性血样所含毒株均属于PCV2d亚型，没有发现其他亚型，这表明PCV2b亚型和PCV2d亚型是当前陕西省屠宰生猪中PCV2的主要流行毒株。相较于PCV2的其他4个亚型，PCV2b亚型是世界范围内最主要的流行毒株[12]。刘玄福等[13]对2015—2017年我国河北北部地区、李金凤等[14]对2017年广西地区的PCV2流行调查发现，除了PCV2b亚型外，PCV2d亚型是当地流行毒株；而邓文芳等[15]对2017—2018年华中地区(湖北省、湖南省和河南省)的PCV2流行调查结果显示，该地区流行毒株竟以PCV2d亚型为主。上述研究表明，PCV2在我国的流行毒株已不再是PCV2b亚型一家独大，而是在由PCV2b亚型向PCV2d亚型转变，且PCV2d亚型有逐渐增多的趋势。本研究与上述研究结果一致，PCV2b亚型和PCV2d亚型在陕西省的屠宰生猪中共同存在，且PCV2d亚型的占比已达到45%(9/20)，提示PCV2d亚型极有可能与PCV2b亚型一样成为未来陕西猪群的主要流行毒株，该结论可为制定针对性防控PCV2措施提供基础资料。

当前，疫苗作为防控PCV2的重要手段仍发挥着重要作用。研究表明，猪群接种PCV2疫苗后可显著降低PCV2的阳性率和感染猪组织中的病毒含量[16]。考虑到PCV2的流行性和变异性所带来的隐性感染和继发感染[17-18]，PCV2仍是我国大规模生猪养殖业安全的重大隐患。通过对各地PCV2的监测和遗传变异分析，可详细获知PCV2在该地区的流行和遗传变化情况，从而有针对地推动当地开展疫苗研制和制定防控计划，这对国内PCV2的防治、养猪业的安全生产及社会稳定具有重要现实意义。