盆栽沃柑生理型黄化现象初步分析

朱文倩，黄奕蔓，王正贤，蒋代华，王忠文，廖咏梅

(广西大学农学院，南宁，530004)

沃柑(Orah)是“塔普尔”桔橙与“丹西”红桔的杂交种，属于宽皮柑桔类型，来源于以色列。我国于2004年由国家果树种质重庆柑桔圃(依附单位为中国农业科学院柑桔研究所)从韩国济州柑桔试验场引进[1]。广西南宁市武鸣区于2012年春季开始引种沃柑，至2018年种植面积13.33万 hm2(约200万亩)，产量约100万 t，估算2020年产量达到250万 t[2-3]。近年，生产中沃柑植株黄化现象日渐突出。关于沃柑植株黄化的原因，仅见黄其椿等[4]综述了前人的研究结果，认为主要分为生理性障碍和病虫危害两大类原因。许多学者对温州蜜柑、金柑、脐橙等多种柑桔的叶片黄化症进行研究发现，叶片黄化主要是叶片中钙、镁、硼、锌、氮、磷、铁等营养元素含量不足所引起的，多数属于综合缺素症[5-8]。柑桔在生产上常通过“高接换种”的方式进行品种更新，可能存在砧穗不亲和性问题。Toplu等[9]研究柑桔不同砧木叶片矿质营养时发现，砧穗不亲和会影响植株吸收、运输养分的效率，出现养分供给不足，从而叶片表现出缺素黄化。廖咏梅等[10]对茂谷柑根系和根区真菌进行研究的结果认为，黄化症状与根系及根区土壤真菌种群有关。菌根真菌可以促进柑桔根系对锌、铁、镁、磷、硼等元素的吸收，减轻黄化症状[11-15]。为了探明沃柑黄化的相关因子，进而为沃柑黄化的综合治理提供依据，笔者自田间采集沃柑黄化植株，盆栽2年后检测叶片中的柑桔黄龙病菌，并对黄化植株与健康植株的根系生长、土壤因子及根系真菌分子种群进行了比较研究。

1 材料与方法

1.1 沃柑植株盆栽2018年4月26日自广西南宁市西乡塘区坛洛镇富庶村田间采集叶片黄化的沃柑苗(2018年2月种植的香橙砧2年生嫁接苗)，自广西热带作物研究所(广西南宁市邕武路22号)的从未耕种农作物的松树下采集表层土壤作为盆栽土壤，采用规格为口径32 cm×高21 cm的聚乙烯花盆，盆栽采集到的黄化沃柑苗后置于防虫玻璃温室内，日常管理主要为按常规方法浇水，每年冬季施一次腐熟鸡粪，两年盆栽期共施过两次腐熟鸡粪，从未换盆加土。在盆栽当年7月所有植株恢复健康，盆栽1年半后部分盆栽植株开始再次出现黄化现象。

1.2 沃柑盆栽土壤及根系样品采集2020年6月15日选择叶片健康绿色的沃柑盆栽植株3株(标记为WGJ1—WGJ3)和叶片黄化的沃柑盆栽植株3株(标记为WGH1—WGH3)为试验植株。将试验植株整株连土取出盆外，将周围根系剪断，并除去表面土壤和根系后，取盆栽土块的中下部土壤和根系，一起装入未启用过的自封袋带回实验室。带回实验室的根系样品，充分抖落表面土壤后，用10目筛(孔径2.0 mm)过筛，取不带白色根尖的褐色根段5～10 g，用去离子水清洗干净并自然晾干表面水分后置于4 ℃冰箱保存。带回实验室的土壤样品，置于空调室内(28 ℃)自然风干，剔除石砾、根系残体等，用研钵磨碎后分别过18目筛(孔径0.88 mm)和100目筛(孔径0.15 mm)，用于土壤pH值及有机质(Organic matter，OM)、全氮(Total nitrogen，TN)、碱解氮(Alkaline hydrolysis N，AN)、速效磷(Available P，AP)和速效钾(Available K，AK)含量的测定。

1.3 柑桔黄龙病菌检测2020年6月20日自“1.2”中的6株试验植株的东南西北四个方向采集叶片样品，用Biospin Plant Genomic DNA Extraction Kit(杭州博日科技有限公司)试剂盒按照说明书提取叶片样品总DNA，用柑桔黄龙病菌特异引物HLBF468/ HLBR877[16]进行PCR检测。引物的核苷酸序列，HLBF468为5’-GCGATTAAGTTAGAGGTGA-3’，HLBR877为5’-TACCATCTCTGATATCGTCCTATA-3’，预期扩增片段长度为433 bp。PCR扩增体系为20 μL，其中DNA模板2.0 μL(30 ng/μL)，正反向引物各0.5 μL(10 μmol/L)，Dream Taq Green PCR Master Mix(2×)10 μL，ddH2O补足至20 μL。PCR扩增循环参数：预变性95 ℃ 3 min，变性95 ℃ 30 s，退火55 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，40个循环，终延伸72 ℃ 5 min，4 ℃保存。阴性对照模板为PCR检测柑桔黄龙病菌结果呈阴性的沃柑健康植株叶片总DNA，阳性对照模板为PCR检测柑桔黄龙病菌结果呈阳性的沃柑植株叶片总DNA。PCR扩增完成后，取5.0 μL PCR产物，用1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统下观察。

1.4 沃柑根系样品真菌高通量测序取在4 ℃冰箱中保存12 h的褐色根段样品，用试剂盒Biospin Plant Genomic DNA Extraction Kit(杭州博日科技有限公司)提取褐色根段样品总DNA。经电泳未发现降解现象后，送生工生物工程(上海)股份有限公司，针对褐色根段样品总DNA中真菌的核糖体内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer，ITS)的ITS2区域(ITS3：5’-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3’；ITS4：5’-TCCTCC GCTTATTGATATGC-3’)进行PCR，用2%琼脂糖凝胶电泳PCR产物，割胶回收目标条带，用GeneJET胶回收试剂盒(Thermo Scientific公司)纯化PCR产物。使用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建库试剂盒构建文库，构建好的文库经过Qubit定量和文库检测合格后，使用HiSeq2500进行上机测序。

测序得到的原始数据(raw data)，通过拼接、过滤，得到有效数据(clean data)。基于有效数据进行OTUs(Operational Taxonomic Units，操作分类单位)聚类和物种分类分析，结合OTUs和物种注释，得到每个样品的OTUs和分类谱系的基本分析结果。最后对OTUs进行丰度、多样性指数分析，挖掘样品之间真菌的组成差异。

1.5 沃柑盆栽土壤样品分析参照鲍士旦(2000)[17]中的方法测定土壤样品中的pH值、有机质、全氮、碱解氮、速效磷和速效钾。其中，pH值用雷磁PHS-25型pH计测定，有机质含量采用重铬酸钾-浓硫酸氧化法测定，全氮含量采用半微量凯氏法测定，碱解氮含量采用碱解扩散法测定，速效磷含量采用碳酸氢钠-钼锑抗比色法测定，速效钾采用醋酸铵浸提-火焰光度法测定。

1.6 数据统计与分析采用Excel进行数据整理，采用SPSS 20.0软件中独立样本T检验进行差异显著性分析(p>0.05为差异不显著，p<0.05为差异显著，p<0.01为差异极显著)。

2 结果与分析

2.1 盆栽表现2018年4月自田间采集的沃柑黄化苗(图1-A)，在温室内盆栽定植后，2018年7月可见所有植株长出的新梢叶片已恢复为绿色(图1-B)。在两年的盆栽过程中，一些盆栽沃柑植株再次出现叶片黄化现象(图1-C，D)。2020年6月15日采集盆栽沃柑根系及土壤样品时发现，相对于黄化植株，健康植株的根系较发达(图1-H，G)。随后，将黄化植株枝条进行深度修剪，并修剪掉外围根系，再加土继续盆栽，2个多月后长出的新梢叶片基本恢复绿色(图1-E，F)。

2.2 柑桔黄龙病菌检测用柑桔黄龙病菌特异引物对HLBF468/ HLBR877对6株沃柑盆栽植株(3株叶片健康绿色，3株叶片黄化)的叶片样品总DNA进行PCR检测，未见扩增条带，说明所检测的6株沃柑植株均未感染柑桔黄龙病菌(图2)。

注：A：2018年4月26日田间将被采集的叶片黄化沃柑苗；B：2018年7月5日拍摄盆栽于温室内的黄化沃柑苗，新梢叶片呈健康绿色；C—D：2020年6月15日拍摄的黄化沃柑苗(C)及其黄化叶片(D)；E—F：2020年8月29日拍摄修剪及断根后的黄化沃柑苗(E)，叶片已恢复为健康绿色(F)；G：盆栽沃柑叶片黄化植株根系；H：盆栽沃柑健康植株根系。

2.3 褐色根段真菌高通量测序真菌门水平的相对丰度：表1可见，健康植株和黄化植株的褐色根段样品中均以子囊菌门为主，相对丰度平均值分别为94.476%和96.479%，经独立样本T检验，两者无显著性差异(p>0.05)。

表1 沃柑褐色根段样品真菌门水平相对丰度 %

真菌科水平的相对丰度：表2可见，在相对丰度平均值位居前5的科中，健康植株和黄化植株的褐色根段均以丛赤壳科(隶属肉座菌目Hypocreales)的相对丰度最高，平均值分别为64.702%和54.844%，经独立样本T检验，两者无显著性差异(p>0.05)。

注：M：2 000 bp DNA分子标记；1—3：健康植株(WGJ1- WGJ3)样品；4—6：黄化植株(WGH1—WGH3)样品；7：阴性对照；8：阳性对照。

表2 沃柑褐色根段样品中位居前5真菌科相对丰度 %

在丛赤壳科中，相对丰度最高的均为腐皮镰孢菌Fusariumsolani，健康植株和黄化植株褐色根段中腐皮镰孢菌相对丰度分别为60.347%和47.069%(见表3)，经独立样本T检验，两者无显著差异。可见，腐皮镰孢菌是盆栽沃柑褐色根段中的主要真菌种类。

表3 沃柑褐色根段样品肉座菌目下真菌种类相对丰度 %

2.4 盆栽土壤分析表4可见，经独立样本T检验，盆栽健康植株和黄化植株土壤之间的pH值及有机质、全氮、碱解氮、速效磷、速效钾含量均无显著性差异(p>0.05)。

表4 盆栽沃柑土壤性状

3 讨论

生产上导致沃柑叶片黄化的重要原因之一是缺素[4]。引起缺素的原因有两个方面：一是土壤中缺乏相应营养元素；二是根系不能正常吸收土壤中的营养元素。本试验自田间采集的沃柑植株为新种植的沃柑苗，果园地面几乎无杂草，经询问当地果农，原因是最近施用了除草剂。故推测，果园新种植沃柑的叶片黄化可能和施用除草剂伤根，导致根系吸收不良有关。采集的沃柑黄化苗在温室中盆栽，3个月后长出的第一批新梢，叶片恢复绿色。分析认为，其原因一是挖出沃柑苗时挖断了大部分的根系，有促发新根的作用，二是温室中的盆栽土壤为自山上松树下采集的未耕作农作物的土壤，从未施用除草剂及其他化学药剂，因此，黄化沃柑苗移植到温室盆栽后，在健康土壤环境中，新根正常发育，吸收作用恢复，新梢叶片即恢复健康绿色。在盆栽近两年后，一些植株再次出现叶片黄化现象，将盆栽植株取出花盆后发现，叶片黄化植株根系明显比叶片健康绿色的植株少，经过重修剪枝条及断根处理，增加土壤继续盆栽，再次长出的新梢叶片呈健康绿色。可见，断根处理可促进新根生长，提高吸收功能，进而使黄化植株新梢恢复绿色；保持土壤健康和根系发达是预防沃柑叶片生理型黄化的重要措施。

腐皮镰孢菌是土壤的习居菌，也是重要的植物病原菌[18-19]，主要为害植株的根系及近土壤的茎基部，引起植物根腐、茎基腐、枯萎等症状，如花椒根腐病[20]、西番莲茎基腐病[21]、桉树枯萎病[22]等。本文高通量测序结果表明，在盆栽沃柑的褐色根段(除去白色根尖)中，主要真菌种类是腐皮镰孢菌。虽然健康植株褐色根段的重要真菌也是腐皮镰孢菌，但健康植株根系发达，相对于黄化植株具有吸收功能的白色根尖数量多，使植株叶片保持绿色。因此，盆栽柑桔时，应尽量避免导致烂根的不当管理，如过量浇水和施肥等，要做到定期换盆、剪除过量的褐根，以促进白根生长和提高吸收功能；同时，进行适当的枝叶修剪，诱发新梢抽发，增强植株长势，也有利于避免植株产生黄化现象。

土壤中有丰富的微生物资源，据估算，1 g土壤中有数千乃至数万种约数十亿个微生物个体[23]，包括固氮菌、解磷菌、解钾菌等，通过微生物的活动，释放土壤中的各种营养元素，满足植物的营养需求。田间栽培条件下，柑桔的根毛很短[24]，一般被认为柑桔根毛少甚至无，高度依赖丛枝菌根替代根毛吸收养分[25]。因此，在沃柑的栽培管理过程中，提倡果园生草、增施有机肥、减少使用化学肥料与农药，以增加土壤有机质和丰富土壤中的微生物菌群，促进沃柑菌根的形成及土壤中营养物质的释放；栽培过程适当进行断根处理，促进新根生长，提高吸收土壤营养物质的能力，减少沃柑自然黄化的概率。

4 结论

在未感染柑桔黄龙病的前提下，田间表现黄化的沃柑植株，移栽到健康土壤环境中盆栽即可恢复绿色；在盆栽过程中，再次出现黄化现象时，经修剪枝条和断根处理，新梢叶片也可恢复绿色。在土壤条件基本一致的情况下，根系发达、白根数量多是沃柑植株健康的必要条件。沃柑褐色根段上的真菌种类主要是腐皮镰孢菌，该菌可加速盆栽沃柑根系的老化和腐烂，使根系群体数量减少，导致植株出现黄化现象。及时换盆断根，可促进新根生长，提高吸收能力，减少黄化植株。在生产中，加强肥水管理，增施有机肥，保持土壤健康，适当修剪枝条和断根处理，可避免或减轻沃柑生理型叶片黄化现象的发生。