RNAA-sseeqq技术在水生生物生态毒理学中的应用进展

柯杨， 马瑜，*， 朱海云， 张育辉

1.陕西省微生物研究所，西安710043；2.陕西师范大学生命科学学院，西安710119

水域是地球环境的重要组成部分，也是最易受污染的生态系统之一，其变化影响着整个生态系统及人类的生存。水生态系统中不同营养级别的水生生物，如甲壳类、鱼类及两栖类等，均可通过摄食、接触等多种途径摄入水体中的污染物；同时，水域污染物也可通过直接毒性（短/长期暴露）和间接毒性（如生殖生理毒性及环境适应性）等多种途径影响水生生物的生存[1]。因此，研究水生生物对水域环境污染的响应有助于快速准确地检测环境污染水平、评价环境风险及寻求新的生物标志物。此外，人口增长和化学工业的发展导致许多污染物和毒素释放到环境中，这些污染物和毒素在环境中的降解、蓄积、迁移和转化过程会对生态系统和人类健康造成威胁。因此，监测这些污染物和毒素对生物体和生态系统的影响是生态毒理学的研究重点，而敏感、有效的生物标志物对生态毒理学研究和环境风险评价具有重要意义[2]。

水生生物生态毒理学可从不同层面阐明有毒化学物质对水生生物以及生态环境的影响，预测并减少或防止水生污染物对环境的有害影响[3]。随着分子生物学的发展，传统以动物为基础的个体、组织和器官水平的毒理学研究，实现了向细胞和分子水平的跨越。此前，基于微阵列和RNA 测序（RNA sequencing，RNA-seq）技术的基因表达分析已经应用于水生物种的生态毒理学研究中[4]。而基于杂交基础的微阵列技术只限用于已知序列，且杂交技术灵敏度有限，难以检测低丰度的目标、重复序列及异常的转录产物，因而逐步被RNA-seq技术所替代。

RNA-seq技术是基于二代测序技术（next-generation sequencing，NGS）进行转录组学研究的方法，应用该方法对特定生理条件下，一个或多个细胞内所有转录产物或所有mRNA的集合进行转录组分析，可全面快速地获得特定状态下的特定组织或器官几乎所有的转录本序列信息，从整体水平上分析基因的转录及其调控规律，精确检出特定基因的表达水平、差异剪接及转录本的等位基因特异性表达[5]。与传统的文库构建、测序相比较，RNA-seq 技术具有所需样品量少、背景信号低、成本较低等优势[6]。此外，在水生生物生态毒理学研究中，RNA-seq 技术可用于分析缺乏基因表达数据和参考基因组（reference genome）信息的非模式生物的毒理分子机制。传统的研究方法受样本量及检测尺度的限制，不能在整体水平上反映细胞中基因转录的情况及调控规律，从而限制了对污染物毒理机制的深入分析；而RNA-seq 技术所需样品量少，可在整体水平上鉴别因环境因子改变而导致的转录组水平差异变化，成为鉴别环境污染物胁迫下机体基因差异表达变化的可靠手段。同时，RNA-seq 技术在寻找新的生物标志物、发现新的毒性通路中也扮演着重要角色。因此，RNA-seq 技术成为水生生物生态毒理学研究的最佳方法之一。

目前，已有许多水生生物作为水生态毒理学研究的指示物种被用于研究污染物对不同生态位水生生物的毒性效应及其作用机制[7]。本文介绍了RNA-seq 技术的基本流程与数据分析过程，同时也对该技术在不同生态位的水生毒理学研究中的应用进展、优势、挑战及发展趋势进行了探讨，以期为该技术在水生生物生态毒理学研究中的应用，尤其是水生态环境中污染物胁迫水生生物机制的阐明及污染水域生态环境恢复提供参考。

1 转录组测序

利用RNA-seq技术进行转录组测序的步骤主要包括文库构建、平台测序及数据分析。平台测序中，目前商业应用的主要有454 FLX SOLiD™（Roche）、SOLiD™（Applied Biosystems）、Solexa GA（Illumina Life Technologies）这 3 个二代高通量测序平台。该平台依赖于体外克隆步骤（克隆扩增）来扩增无细胞系统中每个片段化的cDNA分子[8-9]。

尽管RNA-seq技术的应用使获取转录组序列更便捷，但会产生大量的原始序列，这些序列必须经过生物信息学软件和工具处理才能获得有效的信息，因此，对于测序数据的分析处理尤其重要。利用RNA-seq 得到的海量原始序列需进行过滤、剪切和校正，从而去除低质量序列、短序列、衔接子序列及污染序列，然后再进行读段定位、转录本组装、转录本定量及差异表达分析。常用的RNA-seq测序数据处理工具见表1。

表1 RNA-seq测序数据处理软件Table 1 Processing tools of RNA-seq sequencing data

2 RNAA--sseeqq 技术在水生生物生态毒理学中的应用

随着测序技术的发展，RNA-seq 技术越来越多的应用于水生生物生态毒理学研究中。利用该技术对暴露于污染水体中不同生态位的水生生物进行转录组测序和分析，可获得差异表达基因，进而了解基因的表达情况及其调控机理。同时，RNA-seq 技术的应用，有利于深入研究不同污染物胁迫水生生物的分子毒性机制。此外，转录组测序筛选获得的分子生物标志物，可用于水域环境污染物的评估及预测，对水域环境污染进行预警。

2.1 RNAA--sseeqq 技术在鱼类生态毒理学研究中的应用

鱼类作为水生食物链的顶端生物，是水生态系统的重要组成部分，在水生生物生态毒理学研究中具有重要作用。目前，斑马鱼（Danio rerio）是水生生物生态毒理学研究通用的模式生物。汞是水环境中一种广泛的有毒物质，会对鱼类造成有害影响。采用RNA-seq技术对低浓度氯化汞（24～120 hpf HgCl2）暴露下斑马鱼幼体发育的转录组进行分析，分别获得391 个上调基因和87 个下调基因，包括补体激活（cfb、c3a、c3b和c3c）、化学刺激响应（keap1a、keap1b）、蛋白酶体通路（psme1、psme2）、核受体信号传导通路（nr1d1、nr4a1和nr1d2a）及蛋白激酶（sgk1、sgk2b）等与汞调节相关的基因，上述这些基因可作为潜在的生物标志物，与汞的分析化学检测结合起来，用于检查和评估汞污染的严重程度。此外，还表征了一种新的汞诱导 ABCB（ATP-binding cassette B subfamily）转运蛋白基因abcb5，该基因的过表达可显著降低汞对细胞的毒性。上述研究结果有助于进一步了解斑马鱼幼虫急性接触汞后的转录反应和解毒能力[25]。氯氰菊酯（beta-cypermethrin，BCP）和毒死蜱（chlorpyrifos，CPF）在农业中的广泛应用引起的水环境污染问题已引起广泛关注。对暴露在BCP、CPF及这2种农药混合物下的斑马鱼幼体进行RNA-seq，结果显示，与单一农药暴露组相比，农药混合暴露组对斑马鱼转录组的影响更大，获得的差异表达基因数量更多[26]。

目前，关于污染物对鱼类幼体全转录特征和分子机制的研究主要集中于斑马鱼上，而将RNA-seq 技术用于研究更多鱼类发育中污染物诱导的转录特征，以确定用于监测水生环境中污染物的生物标记物，对于水域生态环境保护具有非常重要的意义。利用RNA-seq 技术对暴露于8.0 mg·kg-1甲基毒死蜱（chlorpyrifos-methyl）前后的大西洋鲑鱼（Salmo salar）脑、肝组织进行转录组分析，结果显示，暴露30 d后，在脑组织中有98个显著差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs），而在暴露 67 d 时仅发现了 2 个；相较之下，在肝组织中分别获得239、258 个DEGs，DEGs累积效应与暴露时间正相关。这说明甲基毒死蜱可影响其脑组织中与神经疾病和脂质代谢相关的基因转录表达[27]。水环境中邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯[Di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP]可通过食物链在水生生物体内积累。通过研究DEHP对罗非鱼肝脏转录组的影响，分别获得3 217个上调基因和1 791 个下调基因。这些差异表达基因主要与机体免疫、生殖内分泌以及脂类代谢相关，可为在转录组水平筛选DEHP 生物标志物、解析DEHP 对罗非鱼毒性作用的分子机制提供科学参考[28]。

在水环境中，污染物通常以复杂化合物的混合物形式存在，与单一污染物相比，可能对生物体产生更为复杂的影响。如石油泄露可影响鱼类种群数量和多样性。通过RNA-seq技术分析重质原油（Iranian heavy crude oil，IHCO）对胚胎发育期的野生牙鲆（Paralichthys olivaceus）及花鲈（Lateolabrax maculates）的发育毒性作用表明，IHCO 暴露可使这2种鱼的基因表达发生改变，其中，具有解毒代谢功能的CYP1A1、CYP1B1、AHR 2等基因显著上调，而发育相关ORG基因则显著下调。此外，牙鲆胚胎对新鲜重质原油和风化的重质原油均敏感，而花鲈胚胎对风化的重质原油比对新鲜的重质原油表现出更高的敏感性，这表明物种特异性差异很可能反映在漏油事件后的种群水平中[29]。

早前的研究大多集中在单一污染物的毒性上，较少关注多种毒物的综合毒性以及它们之间相互作用，采用RNA-seq技术，可鉴定不同物种中对混合污染物有特异性反应的基因，用作环境风险评估的潜在分子标记。因此，RNA-seq 技术是研究污染环境对鱼类生态毒理效应的有效方法，有助于阐明污染物暴露下鱼类的转录调控的分子机制，筛选差异表达基因及生物标志物，为水域环境污染评估提供依据。

2.2 RNAA--sseeqq 技术在两栖类生态毒理学研究中的应用

两栖动物的胚胎及幼体发育过程均在水域中进行，其皮肤对水体中的化学物质具有较高的渗透性，也是检测水域环境化学污染的理想物种。利用RNA-seq 技术研究有机磷杀虫剂敌百虫（trichlorfon）对中国林蛙（Rana chensinensis）成体肝脏的毒性作用机制，共获得3 329 个DEGs，其中，与机体代谢和氧化应激相关基因的mRNA表达水平显著改变。如外源毒性物质对CYP3A具有调节作用，毒性物质敌百虫在机体内的蓄积可抑制CYP3A1基因表达；此外，外源毒性物质可通过转录或有机体体内的不完全降解来影响GST基因的表达，GST基因表达的下调说明它对敌百虫在林蛙体内的毒性降解等生理学过程具有重要作用[30]。水生环境中普遍存在的硝酸盐成分可能对两栖动物的生存、发育和变态有不利影响。利用RNA-seq 技术对硝酸盐（nitrate）暴露前后的中华蟾蜍（Bufo gargarizans）蝌蚪的肝脏组织进行转录组分析，结果显示，硝酸盐暴露可引起胆汁分泌和氧化应激等相关基因在mRNA水平上的表达显著改变，进而导致肝组织病理变化[31]。过量氟会对人类和动物的骨骼发育产生损害。应用RNA-seq技术对持续暴露在1、5、10和20 mg·L-1的氟化钠4周后各处理组中G40 和G42 期B.gargarizans蝌蚪后肢进行转录组测序分析，结果表明，高浓度的氟化物会影响骨化相关基因mRNA 的表达，进而抑制软骨内骨化[32]。

上述研究应用RNA-seq技术获得了污染物暴露下中国林蛙和中华蟾蜍的转录组信息，通过对转录组数据的分析，有助于探究环境污染物对两栖动物生长发育的毒理机制及组织病理变化机制，对了解非模式物种的毒性机制具有重要价值，可为两栖物种的保护提供理论支持。同时，RNA-seq 技术的应用也为两栖物种环境暴露的分子机制提供了研究基础，可作为水环境风险管理以及水生生物生态毒理学研究的依据。

2.3 RNAA--sseeqq 技术在贝类生态毒理学研究中的应用

贝类可通过滤食方式摄食环境中的污染物，也是水生生物生态毒理学研究的理想指示物种。采用RNA-seq 技术分析多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）对扇贝（Chlamys farreri）消化腺转录组的影响发现，PAHs 可显著改变应激反应、解毒、抗氧化等基因的表达[33]。其中，细胞色素P450（CYP4503A2、CYP4502P1）基因、醌氧化还原酶（quinone oxidoreductase，QO）基因和谷 胱 甘 肽-S-转 移 酶（glutathione-S-transferase，GST）基因等上调基因可能作为PAHs 污染的潜在生物标志物，为进一步研究双壳类对PAHs 污染响应的分子机制及生物标志物的选择提供依据。利用RNA-seq 技术对暴露于敌草隆（diuron）的太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）子代幼体进行转录变化研究发现，将亲代暴露于污染物中会导致子代机体中与能量、蛋白质合成及有丝分裂相关基因的转录水平升高，并且会在不同代际间传递[34]。此外，RNA-seq 技术也可用于研究水污染对贝类的生态毒理学效应，结果显示，多瑙河沿岸垃圾倾倒点上下游贻贝（Margaritifera margaritifera）样本转录组信息仅存在细微差异，老龄贻贝的初级代谢和生理机能受到影响，而幼龄个体对暴露于环境中的污染物则具有更好的恢复及适应能力[35]。这一研究表明，年龄相关的个体之间的变异性可对污染物导致的影响产生掩盖或偏差，因此，对于长寿命双壳动物的生态毒理学研究应限制在一个年龄范围内，有利于对研究结果做出正确的判断并对物种采取适当的保护措施。另一项转录组研究结果显示，长期暴露于污水和城市径流中的河蚬（Corbicula fluminea）参与排毒的基因显著上调，说明这2 个位点都存在有机污染。转录组测序的结果表明，接触有机污染物可干扰细胞信号通路，从而导致能量障碍、细胞损伤、免疫紊乱和内分泌紊乱。RNA-seq 技术的应用可在整体水平上观察到对生物体的有害后果之前，对水质污染做出预警[36]。

2.4 RNAA--sseeqq 技术在甲壳类生态毒理学研究中的应用

水域环境或养殖系统的污染也会对甲壳类水生生物产生毒性作用。利用RNA-seq技术对暴露于原油的绿尾虾（Metapenaeus bennettae）肝胰腺进行转录组分析，获得了参与生物体解毒及氧化应激的多种生物标志物，如细胞色素p450（cytochrome P450s）、甲壳类高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormone，CHH)蛋白和热休克蛋白(heat shock proteins，Hsps)，用于判断原油污染的存在[37]。对不同浓度Cd 处理后淡水蟹(Sinopotamon henanense)的肝胰腺进行RNA-seq 测序和基因表达分析的结果表明，Cd 暴露以浓度依赖的方式改变基因表达，参与大分子代谢、氧化磷酸化、解毒和抗氧化防御的基因上调，而除参与吞噬作用外的其他免疫相关基因下调，提示淡水蟹可能通过增加代谢、排毒和抗氧化防御相关基因的表达水平而在转录组水平上降低Cd 的毒性[38]。应用RNA-seq技术考察了大型溞在摄食经纳米银和银离子暴露的斜生栅藻细胞后的基因毒性作用，结果表明，编码磷脂酶PLA2G和磷脂酶D基因的表达量均下调，导致磷脂酶的合成量下降，进而影响到大型溞小肠正常的消化功能及磷脂类脂质的代谢过程[39]。集约化养殖系统和环境污染产生的高浓度氨会对对虾类产生胁迫作用。然而，目前对于该胁迫相关的分子机制知之甚少。应用RNA-seq 技术分析凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）的抗氨氮胁迫关键基因和代谢途径，结果显示，14 个 GO 功能注释和 6 个 KEGG 通路显著改变，在获得的3 145 个DEGs 中有136 个与水生物种中已知的基因具有较高的同源性，有94 个与免疫功能相关，其余的基因参与细胞凋亡、生长、蜕皮和渗透调节。此外，与凋亡和氨氮代谢有关基因表达的改变在减少氨的毒性中起重要作用[40]。上述结果反映了急性氨胁迫早期对基因表达和代谢通路的影响。氨胁迫可抑制免疫系统，增加虾对病原体的易感性，该研究将为进一步研究氨胁迫引起对虾免疫抑制的分子机制提供重要信息。

综上，RNA-seq 技术研究有助于在分子水平上开展污染物毒性作用机理及环境风险早期评价方面的研究。通过对外源污染物胁迫下基因表达动态（上调或下调）和代谢途径变化的分析，可为污染暴露胁迫下机体的代谢反应机理研究提供分子基础，同时也可筛选水生环境重金属污染检测的生物标记物，为水生态环境风险评价提供科学依据。

3 展望

水域是水生生物赖以生存的环境，随着工业化、城市化进程的加速，水污染不仅严重威胁着水域生态系统平衡，影响水生生物的生存、繁衍，还可通过食物链传递，危害人类健康[41]。而RNA-seq 技术在水生生物生态毒理学研究中的应用，对于阐明有毒化学物对水生生物的影响、预测并减少水体污染物对水生生物和环境的影响等均具有优势。目前，水生生物中仅有模式生物斑马鱼和少量水生生物的基因组可作为参考序列，而RNA-seq 技术的应用不需要参考基因组，可直接将得到的序列与数据库中的核苷酸序列进行比对、基因功能分类与注释。

与传统的文库构建、测序技术相较，RNA-seq技术的应用具有一定的优势，如所需样品量少、背景信号低、成本较低。但其技术本身仍存在不足。首先，RNA 提取过程需去除rRNA 会带来改变其他RNA 浓度的潜在风险，有可能使检测到的RNA 发生偏差。其次，测序平台需要在测序之前进行扩增，这一步骤会根据GC 含量和长度引入偏差[42]。与此同时，RNA-seq 技术也面临着一些挑战：①测序所产生的海量数据的高效快捷处理，需要研究开发更好的数据处理方法和软件；②如何通过理论与技术的系统结合，将RNA-seq数据分析、综合、存储与传统生物学、化学、毒理学研究有效结合起来，使其更好地在水生生物毒理学研究中发挥作用，有待更深入的研究；③由于基因组中转录活性变化很大，如何选择合适的测序深度以达到足够的覆盖度并降低检测成本，还需要进一步考量[5]。

在过去的十几年里，RNA-seq 技术的应用对于水生生物对环境污染物的反应所涉及的分子机制的研究起到了很好的推动作用。现有的研究主要是应用RNA-seq技术来研究有毒物质对某一个特定时期的水生生物的影响，而低剂量或实际环境浓度的水域污染对处于不同发育阶段水生生物的毒性作用机制的动态研究尚欠缺，后续需加强这方面的研究[43]。RNA-seq 技术在水生生物生态毒理学研究中的应用，不仅为研究污染物胁迫下水生生物机体转录调控机制提供了便利，而且也为特定药物毒理学研究提供了平台，同时其所产生的转录组数据也可为不同水生生物的相关研究提供理论依据。