转基因耐除草剂大豆的食用安全评价研究进展

张凤， 贺晓云，2， 黄昆仑，2， 汪其怀

1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083；2.农业农村部农业转基因生物安全评价（食用）重点实验室，北京100083；3.农业农村部科技发展中心，北京100176

田间杂草会影响作物生长和产量，传统的物理除草方法虽然安全，但是费时费力。化学除草可以更加高效地除掉杂草，并降低成本，然而化学除草剂的过量使用或不当选择会造成环境污染、无法完全治理杂草等问题[1]。利用转基因技术将抗除草剂基因转移至作物，使其具有耐受除草剂的特性，在减少除草剂使用的同时，提高产量。转基因大豆是目前世界上种植面积最广的转基因作物，其中，大多数种植品种为转基因耐除草剂大豆[2]。尽管转基因耐除草剂大豆已经被大量应用于食品，其食用安全性仍然受到质疑。本文对转基因耐除草剂大豆进行了概述，分析了其存在的安全性问题，并详细阐述了食用安全性评价方法，以期为转基因耐除草剂大豆建立安全评价体系提供理论基础。

1 转基因耐除草剂大豆概况

1996 年，美国孟山都公司研发的转基因抗草甘膦大豆（GTS）40-3-2 品系被第一个批准用于商业化种植[3]。至2017 年，全球转基因大豆种植面积已超过9 000 万hm2，占所有转基因作物种植面积的50%，美国、巴西等作为转基因大豆的种植大国，其种植应用率在90%以上[4]。截至目前，转基因耐除草剂大豆已有超过30 个品种用于商业化种植，种植面积居转基因大豆的首位。根据国际农业生物技术应用服务组织（the International Service for the Acquisition of Agri-Biotech Application,ISAAA）统计信息显示，用于种植的转基因耐除草剂大豆主要有耐有机磷除草剂、耐激素除草剂以及耐多类除草剂的转基因大豆类型。

耐草甘膦转基因大豆作为最早种植的品种，也是当前应用最广的耐有机磷除草剂的转基因大豆[5]。农杆菌菌株CP46的Cp4 epsps基因是其主要插入的外源基因，该基因通过在植物体内表达并合成5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶赋予植物高水平的草甘膦耐受性[6]。耐草铵膦转基因大豆则是另一种广泛应用的耐有机磷除草剂的转基因大豆，表达吸水链霉菌的bar基因[7]。耐麦草畏转基因大豆是转入土壤嗜麦芽窄食单胞菌DI-6菌株中合成麦草畏单加氧酶（DMO）基因的一种耐激素除草剂转基因大豆[8]。DMO 可快速催化麦草畏氧化脱甲基生成3,6-二氯水杨酸（DCSA）和甲醛，发挥抗性。为满足更加高效的田间管理和作物生产，还出现了耐多种除草剂的转基因大豆。MON87708×MON89788品系大豆可耐受麦草畏和草甘膦，DAS-444O6-6 品系可同时耐受草甘膦、草铵膦和2,4-二氯苯氧乙酸[9-10]。除此之外，还有如MON87701×MON89788 品系大豆兼具耐草甘膦和抗鳞翅目害虫的特点[11]。

表1 已批准商业种植的转基因耐除草剂大豆Table 1 Genetically modified herbicide tolerant soybeans approved for commercial cultivation

虽然国际上转基因大豆种植面积日益扩大，但是我国尚未批准商业化种植转基因大豆[12]。尽管如此，早在20 世纪我国便开始转基因作物的相关研究，现已拥有了一批具有自主知识产权的转基因耐除草剂大豆。例如转G2-EPSPS 和GAT 基因的ZH10-6 耐草甘膦大豆、转AM79-EPSPS 基因的耐草甘膦大豆及转G10-EPSPS基因的抗除草剂转基因大豆SHZD32-01 等，都具有良好的性状[13-15]。这些品系一些已进入我国转基因植物研究的中间试验阶段或环境释放阶段，但还需要进行一系列严格的安全评价才能被批准应用。

2 转基因耐除草剂大豆的安全性问题

转基因耐除草剂大豆以及其他转基因作物已经生产种植了二十多年，其制作的饲料、食物在世界范围内应用广泛[16]。尽管每一种转基因耐除草剂大豆上市前都经过系列安全评估，但是公众对转基因耐除草剂大豆生产的食品和饲料仍然争议不断，争论的焦点主要集中在转入基因后是否产生毒性、过敏性及大豆的营养成分是否改变等方面。

2.1 外源基因和蛋白的毒性

转基因耐除草剂大豆通常是利用现代生物技术将外源DNA 转入受体细胞中，经培育得到。这个过程的变量是外源DNA，因此，首先被考虑的便是转入的DNA 对人体是否有毒性。人体每天摄入来自植物性和动物性食物的DNA 在0.1～1 g左右，这个摄入量对人体不具有毒性[17]。同时，DNA 进入人体后会被消化系统水解，不会产生直接毒性。根据美国食品和药物管理局（Food and Drug Administration, FDA）相关政策，核酸存在于每个生物体内，作为食物的成分来说不存在安全风险，被认为是安全的[16]。对于一些质疑，如DNA可能在消化吸收时转入人体内或肠道微生物中，目前尚没有确凿的证据证明这种现象存在。

转入的外源DNA 在转基因耐除草剂大豆作物内表达相应的蛋白，使其获得耐受除草剂的特性，外源蛋白是否具有毒性也是被关注的焦点。转入的DNA 本身可能与大豆内的其他基因发生相互作用或受环境等影响发生变异，导致基因断裂、缺失等突变发生，使得其表达的蛋白数量与性状发生改变[18]。因此，证实外源蛋白的安全性和是否有其他有毒物质产生十分重要。在转基因耐除草剂大豆中表达的外源蛋白还未发现对人体有毒性，但也需要谨慎对待。

2.2 过敏性

表达的新蛋白是否会引发过敏反应也是人们关注的重点问题。1994 年，美国先锋种子公司曾尝试在大豆中转入巴西坚果中编码蛋白质2S albumin的基因，但在测试阶段发现对巴西坚果过敏的人群同样也对这种转基因大豆过敏，项目不得不终止[19]。但是在研究耐除草剂转基因大豆过程中，尚未发现人群对相关蛋白的过敏现象[20]。1992 年，FDA 给出了第一种评估食物蛋白质过敏性潜在风险的系统方法，2010 年由欧洲食品安全局（European Food Safety Authority, EFSA）转基因生物小组（genetically modified organism, GMO）起草并于2011 年更新的转基因生物过敏性风险评估指南中建议使用证据权重方法，用于转基因饲料和食品中新表达蛋白质的过敏性风险评估[21]。

2.3 营养成分改变

大豆通常由35%～40%的蛋白质、20%左右的脂类、9%的膳食纤维和8.5%左右的水组成，不含胆固醇，富含异黄酮、皂甙等多种生物活性成分，具有调节生理功能和预防慢性病的作用[22]。转入外源DNA 后，大豆内的营养组成可能发生变化，或者引入的基因与大豆中其他营养素基因发生相互作用，使蛋白质表达发生改变[18]。由于耐除草剂的基因对大豆的营养成分改变不能完全预知，人体如果摄入营养价值改变的大豆可能会影响自身健康。实际上，还没有证据表明食用转基因耐除草剂大豆会对人体和动物的健康或者营养状况有不良影响。

2.4 抗营养因子

除了作为蛋白和油料资源外，大豆本身还含有胰蛋白酶抑制剂、大豆凝集素、脲酶、植酸等多种抗营养因子，会影响动物和人的健康。与外源DNA 对营养成分的影响类似，转入的基因可能改变大豆的抗营养因子组成和含量。因此，对于转基因大豆还需要把握抗营养因子的变化情况。现有研究表明，耐除草剂转基因大豆的抗营养因子与非转基因大豆之间没有显著差异，具有等同性[23]。

3 转基因耐除草剂大豆的食用安全性评价方法

所有应用于食品的转基因作物上市前都要经过系列食用安全性评估，转基因耐除草剂大豆也不例外。目前，食用安全性评估主要采用经济发展合作组织（Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD）在 1993 年提出的实质等同原则，即利用生物技术产生的食品及成分与当前市售的食品具有实质等同性即视为安全[24]。评价方法主要有毒理学评价、过敏性评价和营养学评价等。

3.1 毒理学评价

耐除草剂转基因大豆的毒理学评价首先是针对外源基因表达的蛋白质与已知有毒性的蛋白质和抗营养因子在氨基酸序列相似性上的特征比较；其次，若与已知有安全食用历史的蛋白不相似时，应进行经口毒理学试验[25]。而蛋白质以外无安全食用历史的其他成分的潜在毒性评价应参照传统毒理学方法进行，包括亚慢性毒性、慢性毒性、遗传毒性和生殖发育毒性等毒性评价；同时，因转入外源基因引起的大豆特性改变需要进行喂养实验和其他必要的毒理学实验进行评价[25]。

2016 年，一项对转基因耐麦草畏大豆的研究中发现该转基因大豆表达的DMO 与野生型DMO的氨基酸序列同源性为91.6%～97.1%，且所有DMO 形式都保持了Rieske 加氧酶的特性，而这些酶具有安全使用的历史[26]。多个国家都曾采用转基因抗除草剂大豆进行动物亚慢性毒性实验和生殖能力检测。日本研究人员在大鼠基础日粮中添加30%浓度的转基因大豆或非转基因大豆，分别进行52 周和104 周两项慢性喂养实验，同时为了评估大豆本身的影响，还将喂养转基因和非转基因大豆的大鼠组与喂养商业饮食的大鼠组进行了比较，血液学、血清生化和病理学检查、动物生长情况等结果表明，长期摄入30%的转基因大豆对大鼠没有明显的不良影响[27-28]。我国研究人员Zhu 等[29]使用转基因耐草甘膦大豆饲喂大鼠13周，监测了体重、进行了血液学指标、尿常规和病理学检查，发现动物没有出现亚慢性中毒现象。在生殖毒性方面，我国研究人员在饲料中添加20%（质量分数）加工好的转基因耐草甘膦大豆豆粕或近等基因非转基因豆粕，喂食雄性SD 大鼠90 d，每日监测体重和行为，检测血清酶、睾丸组织学和电镜表现，以及精子形态，结果发现，饲喂转基因大豆的大鼠未观察到任何不良反应[30]。美国研究人员也曾对小鼠进行类似的实验，得出转基因耐草甘膦大豆对小鼠无生殖毒性的结论[31]。意大利研究人员曾经进行了转基因大豆喂养小鼠240 d的传代试验，检测结果显示小鼠脏器中核酸转录活性改变，作者认为是由于大豆中的抗草甘膦基因引起的。但是，这些检测指标不是毒理学的常用指标，并且也没有动物相关指标自然范围的数据支持。因此，EFSA认为这些发现的毒理学相关性尚不清楚[32-37]。类似的，也有一些试验认为转基因大豆可能与肝脏老化和胰腺病变有关，但这些试验的科学性尚有待探讨[38-39]。

3.2 过敏性评价

针对外源基因表达蛋白质的过敏性评价应当遵循整体、分步和个案分析的原则，实现综合评价。主要包括根据供体生物过敏性的信息确定评价方法、外源基因表达蛋白质与已知过敏原氨基酸序列同源性比较、外源基因表达蛋白质在加工和胃肠消化过程的稳定性三个方面[25]。

一项对转基因耐麦草畏大豆中DMO 的过敏性评价结果表明，DMO 序列中没有一个与任何已知的过敏原或毒素相似，并采用证据权重法进一步评价DMO 蛋白的安全性，纯化的DMO 蛋白在体外55℃及以上的温度下加热活性完全丧失，并且分别可在30 s 或5 min 内被胃蛋白酶和胰酶完全消化；小鼠经口灌注DMO 蛋白喂养实验未显示出任何不良反应，这些结果表明各种形式的DMO蛋白质对于食物和饲料消费是安全的，并且DMO活性位点之外的小氨基酸序列差异不会引起任何额外的安全问题[26]。对转基因耐草甘膦大豆中CP4 EPSPS 蛋白的过敏性分析表明，该基因的供体土壤农杆菌不是一种已知的过敏原，该蛋白与公共数据库（GenBank、EMBL、PIR 和SwissProt）中的已知过敏原没有高度的氨基酸序列同源性。该蛋白可以在模拟胃液和模拟肠液中被迅速消化。截至2020 年，美洲、欧洲以及亚洲都有研究使用易过敏儿童和成年人的血清与转基因耐草甘膦大豆提取物和CP4 EPSPS 蛋白进行的特异性IgE 结合试验，结果未发现该蛋白与任一过敏血清结合，而转基因大豆提取物和非转基因大豆提取物的内源性过敏原的种类和数量没有明显差异[40-45]。采用SD 大鼠所做的动物体内体外致敏刺激试验也证实了CP4 EPSPS蛋白注射或灌胃都不会引起动物的过敏反应[46]。2010 年，一项对耐异恶唑酮和草甘膦的FG72 大豆进行的过敏性评价实验中，FG72 大豆种子中的过敏原水平没有显著增加[47]。因此，大豆中转入DMO、CP4 EPSPS 等外源蛋白没有增加新的过敏性风险。

3.3 营养学评价

耐除草剂转基因大豆的营养学评价应考虑大豆中营养成分、抗营养因子等相关成分的自然变异范围等因素的影响，以及加工条件下对大豆中这些成分的含量、结构、功能和生物利用率的影响[25]。

历史上在不同时间、不同地点对转基因耐除草剂大豆已经进行了多次独立的营养成分分析，如美国 1992—2011 年多个地点，欧洲 2005 年 5 个地点，巴西2007—2009 年多个地点[48-53]的分析试验。在2000—2002 年美国和加拿大两地持续对多种遗传背景的转基因耐草甘膦大豆和它的亲本大豆的营养成分分析均表明，二者在大部分营养成分和抗营养因子含量和组成方面无明显差异，均在相应范围内[54]。2017年一项对于耐受多种除草剂的转基因大豆的评价中，将收获的具有耐麦草畏和草甘膦的大豆中重要营养素和抗营养素的水平与亲本非转基因大豆及普通大豆进行比较，结果表明基因修饰对相关成分没有影响[55]。因此，插入耐除草剂基因对大豆的营养成分没有显著影响。

动物喂养试验常用来评价转基因作物营养成分的生物利用率。使用转基因耐草甘膦大豆和非转基因大豆饲喂鹌鹑、大鼠、牛、鸡等动物后，检测它们的体重、饲料转化率、肌肉和脂肪组成（鸡）、牛奶产量和牛奶成分等，发现两种大豆对动物的营养价值没有差别，这些动物试验中大豆的饲喂量达到人体摄入量的100 倍，也足以说明转基因大豆对动物和人体的安全性[56]。2017 年，一项研究以朝鲜鹌鹑作为实验动物，随机分成5 个处理组，用含有28%和70%的转基因耐草甘膦大豆和非转基因对照大豆以及常规基础日粮饲喂鹌鹑90 d，观察其对鹌鹑健康状况和生理指标的影响，记录各组动物体重和摄食量，并在实验末期收集血液解剖动物进行病理观察，计算脏器系数，90 d亚慢性毒性实验表明，转基因大豆对鹌鹑没有产生不良反应[57]。

4 展望

转基因耐除草剂大豆已经商业化种植了二十多年，迄今为止还没有观察到任何不良反应。尽管种植转基因耐除草剂大豆的优势非常明显，但仍有一部分人存在怀疑。随着生物技术的不断发展，采用新技术研发的新一代转基因作物可能会涉及更复杂的安全评估。因此，需要建立完整的转基因作物食用安全性评估体系并不断完善才能更好地评价转基因耐除草剂大豆的安全性，减少公众的顾虑，促进更多优势转基因作物的商业化应用。