Myostatin基因突变激发骨骼肌发育机制研究进展

高丽， 杨磊， 李光鹏*

1.包头师范学院生物科学与技术学院，内蒙古包头014030；2.内蒙古大学生命科学学院，省部共建草原家畜生殖调控与繁育国家重点实验室，呼和浩特010030

肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN），转化生长因子β（transforming growth factor β，TGFβ）超家族成员，是骨骼肌生长与发育的负调节因子，在不同物种中具有极强的进化保守性。MSTN基因突变通过促进肌纤维数量和肌纤维尺寸的增加导致肌肉肥大。肌肉质量是畜牧生产中重要的性状，具有重要的经济价值，因此MSTN基因受到了广泛关注。

目前已经发现并通过基因编辑技术获得了多种MSTN基因突变动物，包括牛[1-2]、绵羊[3]、狗[4]、猪[5]、山羊[6]和鸟类[7]等。在MSTN基因编辑动物中，仅对MSTN基因序列的小片段碱基进行删除，不会影响其基因的结构完整性和动物基因组结构，却可以使肌肉出现明显的过度生长现象。因而，关于MSTN基因突变导致肌肉过度发育的作用机理成为研究热点。本文将从成肌细胞增殖、分化、蛋白质合成分解代谢、组蛋白修饰以及巨噬细胞极化等5 个方面对MSTN突变促进肌肉发育的机理进行综述，以期为农业动物育种新材料生产及重大恶病质的治疗提供借鉴。

1 MSTN 基因突变通过调控细胞周期影响肌卫星细胞的增殖分化

骨骼肌中存在未分化的肌源性前体细胞——肌卫星细胞（muscle satellite cells，MSCs）[8]，骨骼肌的生长主要依赖于这一类细胞。在幼年生长时期，MSCs保持增殖状态以增加生长的肌纤维中的细胞核，之后，随着肌纤维直径不断增加，MSCs增殖速度逐渐减慢[9]。到成年时期，MSCs 保持静止状态，直到肌肉损伤诱导其活化[10]。研究表明，敲除MSTN会促进细胞增殖，而过表达MSTN会抑制细胞增殖和DNA 合成[9]。进一步的研究发现，MSTN基因突变可通过调控细胞周期进程，影响MSCs的增殖与分化过程，从而实现对肌肉发育的调控。通过RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术抑制C2C12 细胞中MSTN基因的表达，细胞周期显著加快，其中，G0/G1期细胞减少，而S期细胞增加[11]。在本团队的研究中得到了一致的结果，MSTN基因被敲除后，G1/S 期细胞比例减少，S 期和G2 期细胞增加，这一结果表明MSTN基因敲除可促进DNA 的合成，激发细胞增殖[12]。经过检测细胞周期相关基因的表达情况，发现MSTN基因敲除可以下调抑制细胞周期的基因的表达，而上调细胞周期蛋白（Cyclin）和周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent protein kinase，CDK）的表达[13]。进一步研究其作用机理发现，MSTN基因上调通过增加其下游转录因子pSMAD3 与CDK 抑制因子p15、p16 和p27 的启动子结合，来上调这些CDK 抑制因子的表达，进而抑制细胞周期进程[14]。同时，MSTN基因会通过 PI3K/AKT/GSK-3β 途径降解周期蛋白D1，从而使细胞周期停滞[15]。由此可见，MSTN可通过影响细胞周期来影响肌肉发育。

2 MSTN 基因通过调节肌肉发育关键基因调控肌肉发育进程

在许多物种中，MSTN突变导致的肌肉异常发达现象是因MSTN突变而产生的肌纤维数量增多和体积增加共同作用的结果[3-4]。肌肉质量是动物生产中的重要指标，因此，为了制备肌肉发达的改良畜牧物种，研究人员在开发有效策略以阻断MSTN的表达方面做了诸多努力与探索[6,16-17]。MSTN基因被激活后，会与其受体ActⅡB结合，使下游转录因子SMAD2/3 磷酸化，磷酸化的SMAD2/3 与 SMAD4 形成复合物[18]，随后进入细胞核调控成肌发育关键基因的表达，进而抑制肌肉发育过程[19]。研究表明，MSTN过表达会通过下调肌肉发育关键基因MyoD和MyoG的mRNA 水平来抑制肌生成过程，从而阻断成肌分化[20]。相反地，干扰内源性MSTN表达或MSTN突变会促进成肌分化过程[21-22]。MSTN基因突变的牛MSCs 成肌分化能力显著增强，成肌关键因子MyoD、MyoG以及MYF5基因的表达显著上调[21]；在猪中，通过CRISPR/Cas9技术制备的MSTN基因突变猪，其背最长肌中成肌分化关键基因MyoD、MyoG以及MYF5基因的表达显著上调[22]。这些研究表明，MSTN基因突变改变了成肌关键因子的表达，从而影响成肌细胞分化及肌肉发育进程。

3 MSTN 基因通过调控蛋白质合成与降解调节肌肉发育

MSTN缺失导致的肌肉发达同样被认为与蛋白质合成增加有关[23]。研究认为，MSTN敲除可能会促进胰岛素样生长因子1（insulin like growth factor 1，IGF1）与其配体结合，从而激活PI3K/Akt信号通路，使 Akt 磷酸化；mTOR 是 Akt 下游的一个激酶，会使翻译因子4E 结合蛋白1（4E binding protein 1，4E-BP1）和p70 核糖体蛋白S6 激酶（p70 ribosomal protein S6 kinase，p70s6k）磷酸化，从而诱导蛋白质的合成[24]。在体外培养的肌管中过表达MSTN基因会降低Akt 磷酸化程度，而抑制MSTN的表达则会促进Akt 磷酸化[25-26]。在小鼠中，MSTN的过表达同样会降低Akt 以及其他Akt/mTOR 信号转导成分（包括TSC2、核糖体蛋白S6和4E-BP1）的磷酸化[27]；而敲除MSTN，则会增加Akt 的磷酸化，促使 S6 和 S6 激酶 S6K 的表达[25,28]。此外，MSTN基因突变还可通过调控SMAD的磷酸化，激活Akt/mTOR 途径[29]。在培养的日本比目鱼肌肉细胞中，过表达MSTN基因同样会导致Akt磷酸化程度降低，并显著抑制mTOR和Akt/FoxO1信号通路，激活的Akt 诱导激活mTOR 信号通路，导致蛋白质合成增加[30]。同样地，在本团队前期的研究中，对MSTN基因突变牛骨骼肌进行转录组分析，结果显示，差异表达基因显著富集到了蛋白质及其磷酸化信号通路，且同样富集到了PI3K-Akt 信号通路，表明MSTN敲除通过该信号通路影响蛋白质合成及其磷酸化，从而导致肌肉发达[12]。

肌肉质量是由蛋白质合成和蛋白质降解共同控制的。肌肉萎缩是蛋白质降解增加和蛋白质合成减少所致[31]。在蛋白质降解过程中，泛素蛋白酶体系统发挥重要作用[32]。MSTN基因被发现不仅仅影响蛋白质合成，同时对蛋白质降解具有重要的调控作用。研究表明，在日本比目鱼肌肉细胞中过表达MSTN基因，会显著上调泛素蛋白酶水解途径的基因表达[30]，表明MSTN基因过表达会促进泛素蛋白水解酶体系对蛋白质的降解，从而抑制肌肉发育。在癌症引起的恶病质肌细胞中，MSTN基因也被发现可以通过抑制蛋白质合成并激活泛素蛋白酶水解途径和自噬-溶酶体途径降解蛋白质，对肌肉萎缩起到双重作用[32-33]。

4 MSTN 基因通过表观修饰调控影响肌肉发育

4.1 表观修饰与肌肉发育的关系

研究表明，表观修饰（如DNA 甲基化、miRNA、LncRNA以及组蛋白的甲基化和乙酰化等）都对肌肉发育起着重要的调控作用。研究表明，在鸭胚的发育过程中，温度会调控肌肉发育基因的表达，进而调控肌肉发育过程，而这一作用发生的机制就是通过影响肌肉发育基因的启动子区甲基化实现的[34]。面肩肱型肌营养不良症（facioscapulohumeral muscular dystrophy，FHSD）的发生是一些重复的卫星序列缺失致使肌肉发育的关键基因甲基化程度降低，从而导致基因表达失调，影响了肌肉发育过程[35-37]。这些研究均显示，在肌肉发育过程中，涉及到一系列肌肉发育相关基因的甲基化与去甲基化导致的基因表达激活和抑制，表明DNA甲基化在肌肉发育过程中具有重要作用。

在组蛋白甲基化调控肌肉分化期间，活跃转录的基因被组蛋白H3 第4 位赖氨酸的三甲基化（histone H3 lysine 4 trimethylation，H3K4me3）标记，准备转录的基因被H3K4me2标记。组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase，HDAC）和SIRT 蛋白失活后，可以激活肌肉分化相关的转录因子，从而启动肌肉分化程序[38]。研究人员对猪骨骼MSCs 和分化的肌管进行转录组和染色质免疫共沉淀测序（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）技术分析，结果表明在分化的肌管中肌源性基因表达显著上调，其组蛋白H3K27me3修饰显著下降，且该修饰同时调控细胞增殖基因的表达[39]。

H3K27me3 可通过其与MyoG基因启动子的结合抑制MyoG基因的表达，从而维持骨骼肌细胞的增殖。分化前C2C12 细胞基因组中总体H3K27me3 修饰水平显著高于分化后细胞[40]。在小鼠早期胚胎的肌节中，通过高表达甲基化酶EZH2 和 H3K27me3 修饰来抑制MyoG基因的表达，从而抑制成肌细胞分化而促进其增殖[41]；绵羊成肌细胞中MSTN基因敲除后，甲基化酶EZH2的表达被上调，H3K27me3 修饰增强，从而抑制分化，促进肌细胞增殖[42]；在出生前后的绵羊骨骼肌基因组启动子中，存在大量H3K27me3 修饰抑制基因的转录[43]。这些结果表明，H3K27me3修饰参与MSCs 的分化与增殖过程，从而调控肌肉发育过程。

4.2 MSTN 基因通过调控表观修饰调节肌肉发育进程

研究表明，MSTN基因突变对DNA 甲基化修饰具有重要作用[21]。本团队对MSTN突变和野生型牛肌肉组织进行转录组测序分析，研究发现富集到的GO 条目主要包括肌肉发育、成骨分化、细胞增殖分化与凋亡、蛋白质磷酸化以及基因表达的调控等[12]。更为重要的是，结果表明MSTN基因突变会影响DNA 甲基化相关酶类的表达。这些结果提示MSTN基因突变可能通过影响DNA甲基化修饰调控肌肉发育过程[12]。进一步研究发现，MSTN基因突变后成肌因子发生了显著的去甲基化；MSTN基因突变后DNA 甲基转移酶（DNA-methyltransferase，DNMT）表达下降，去甲基化酶——甲基胞嘧啶双加氧酶（tet methylcytosine dioxygenase，TET）家族中TET1的表达显著上调，且其上调程度大于DNMT 的下调程度[21]。这些结果表明MSTN基因突变可能通过上调去甲基化酶TET1的表达促使成肌因子发生去甲基化，从而上调成肌因子的表达水平。进一步通过ChIP 及双荧光素酶报告试验证明，MSTN基因下游的转录因子SMAD2/SMAD3 通过与去甲基化酶TET1 的启动子结合而抑制其表达，从而调控TET1介导的去甲基化过程；当MSTN基因突变后，转录因子SMAD2/SMAD3对TET1的抑制作用减弱，TET1基因表达上调，使成肌因子发生去甲基化，从而促进成肌分化过程（图1）[12]。

图1 MSTN基因突变调控TET1介导的去甲基化作用机制[12]Fig.1 The possible mechanism of MSTN mutant regulated the TET1 mediated demethylation[12]

关于MSTN基因与组蛋白修饰之间的关联性也有一些研究，研究人员发现敲除原代分离的绵羊成肌细胞中的MSTN基因，会导致H3K27me3的甲基化酶EZH2 的表达上调，并促进肌细胞的增殖过程[44]。在C2C12 成肌细胞向成脂细胞转分化过程中，当MSTN基因的表达被敲减后，会通过调控组蛋白去甲基化酶JMJD3的表达来调控成脂基因的表达，从而调控成脂转分化过程[45]。上述研究表明，MSTN基因突变可以通过影响表观修饰调控肌肉发育过程。关于MSTN基因突变与miRNA、LncRNA、组蛋白乙酰化等修饰之间的相互作用尚未见报道，随着进一步的研究可能会发现更多MSTN基因突变调控表观修饰的证据。

5 MSTN 基因通过影响巨噬细胞极化促进损伤骨骼肌的修复再生

5.1 巨噬细胞极化在骨骼肌损伤修复中的作用

骨骼肌损伤是运动医学中最常见的一种损伤，对损伤修复机理的研究以及损伤修复手段的探索是该领域的研究热点[46]。骨骼肌中存在一类静止的卫星细胞，当骨骼肌受到急性损伤时，这类静止的卫星细胞便会被激活、增殖、分化，进而融合形成肌管，完成损伤肌肉的修复[47]。近年来研究表明，在骨骼肌损伤修复过程中，除MSCs 外，巨噬细胞的极化，即巨噬细胞对不同表型的获取[48]同样发挥重要作用[49]。在肌纤维损伤和再生过程中，巨噬细胞存在2 种亚型——具有促炎属性的M1 型和抗炎属性的M2 型[50-51]。在骨骼肌损伤后，促炎因子和趋化因子释放招募骨髓源性单核细胞进入损伤区域，并成熟为巨噬细胞，之后，巨噬细胞极化为M1 型巨噬细胞，通过一氧化氮体系在肌肉损伤部位促使炎症加重[52]，同时激活MSCs 使其大量增殖。随后转换为M2 型巨噬细胞，消除炎症并介导组织再生和血管生成，促进受损骨骼肌成肌细胞分化融合，完成损伤修复[53]。

5.2 MSTN 基因与巨噬细胞源性因子之间的相互作用

关于MSTN基因在骨骼肌损伤修复中与巨噬细胞之间的相互作用，尚未见报道。但有许多研究已经表明，MSTN基因与巨噬细胞分泌的促进肌肉损伤修复的细胞因子之间存在重要相互作用。IGF1 是由巨噬细胞分泌的，是肌肉生长的一个主要的正调控因子[54]，与MSTN基因之间存在相互作用，在肌肉损伤修复中发挥重要功能。在正常条件下，IGF1信号会阻断MSTN的通路；IGF1与其受体结合激活PI3K/Akt 信号通路，使Akt 磷酸化，使下游FoxO基因停留在细胞质中并抑制其表达。而MSTN基因可以通过抑制Akt 的磷酸化提高FoxO的活性，增强肌肉萎缩相关基因的表达。因此，IGF-1 与其受体结合后可以抑制FoxO的活性，抑制肌肉萎缩基因的表达[55]，从而促进肌肉发育。

在骨骼肌损伤修复中，炎性细胞因子发挥重要作用，且巨噬细胞是主要的炎性细胞。如白细胞介素IL-6 等因子会通过经典的NF-κB 以及Notch 信号通路参与骨骼肌损伤修复。TGF-β 信号通路与Notch 信号通路之间也存在相互作用，激活Notch 信号通路会抑制TGF-β 信号，下调MSTN的转录，从而导致肌肉增加[56]。

除 IGF1 和 Notch 信号通路外，MSTN基因与巨噬细胞分泌的肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）之间同样具有相互调控作用。HGF 通过调控MSCs 的增殖、分化、迁移等功能参与骨骼肌再生[57]。HGF 对MSTN基因表达起负向调节作用，从而正向调控MSCs的激活[58]。这些研究表明，MSTN基因与巨噬细胞源性细胞因子之间具有重要的相互作用，而这些巨噬细胞源性因子都会通过影响巨噬细胞M1/M2 极化参与骨骼肌的修复损伤。上述结果提示，MSTN基因突变可能通过调控巨噬细胞M1/M2 极化来促进骨骼肌的损伤修复。对MSTN基因突变牛肌肉组织的转录组测序分析发现，差异表达基因最显著富集的GO 条目是“调节免疫系统过程”“免疫系统过程”，同时也富集到了“细胞因子产生的调节”“巨噬细胞激活”等条目；在差异表达基因中，显著富集到了巨噬细胞M1和M2极化相关的基因[12]。由此可以推测，MSTN基因突变对于巨噬细胞M1/M2 极化具有重要作用，MSTN基因突变可能通过调控巨噬细胞的极化促进肌肉发育，从而在骨骼肌损伤修复过程中发挥作用。

6 展望

自然界中存在许多MSTN自然突变导致肌肉肥大的动物[3-4]，MSTN基因在肌肉发育中起到的重要的调控作用，使其对于农业生产甚至疾病治疗具有重要意义，基于此，研究人员通过基因编辑技术制备了许多人工编辑的MSTN动物突变[16-17]。随着其作用机理研究的不断深入，发现MSTN不仅调控肌肉发育，对于脂肪合成代谢[59]、糖代谢[11]以及骨骼发育[60]等生理过程都具有重要作用。对MSTN基因突变影响肌肉发育机理的深入揭示，对于农业动物产肉性能提升及重大疾病治疗具有重要的指导意义。通过基因编辑技术制备的MSTN突变个体，不仅可以用作培育优良动物的育种材料，还可以将其作为肌肉萎缩及恶病质等疾病的药物筛选模型，对于治疗相关疾病具有重要作用。未来对于MSTN基因的研究也应着重探索MSTN控制肌肉发育与其他组织代谢通路之间的相互作用，以及MSTN基因引起的肌肉过度发育与组织微环境之间的关系，比如MSTN基因突变对巨噬细胞的影响等。只有把机体不同组织之间以及与组织微环境之间的相互关联研究清楚后，才能够更好的应用于动物生产与临床实践中。