UPLC-PDA同时测定肝复康丸中10个成分含量及主成分分析

王会品，王金梅

1.郑州市第三人民医院，河南 郑州 450000；2.河南大学 药学院，河南 郑州 475000

肝复康丸是由五味子、太子参、白花蛇舌草3味中药按2∶1∶1的处方比例制备而成的水蜜丸，收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂》第7册，具有收敛、益气、解毒、降谷丙转氨酶的功效，用于急慢性肝炎、早期肝硬化和肝功能不良等症[1]。五味子具有收敛固涩、生津止渴、补肾宁心的功效，临床用于治疗久咳虚喘、梦遗滑精、自汗盗汗、内热消渴、心悸失眠等症。现代天然药物化学、药理学研究证明，木脂素类成分是五味子中最主要的生物活性成分，具有保肝、抗氧化、抗肿瘤等作用[2]；太子参具有益气健脾、生津润肺的功效，其指标成分太子参环肽B具有抑制酪氨酸酶和黑色素产生的作用[3]；白花蛇舌草为临床常用治疗恶性肿瘤和各种炎症的中药，其黄酮类化学成分具有抗肿瘤、抗化学诱变的药理活性[4]。《中华人民共和国卫生部药品标准·中药成分制剂》第7册采用化学鉴别法定性分析肝复康丸，缺少定量分析指标，文献报道仅限于采用高效液相色谱法(HPLC)测定肝复康丸中五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素等成分的含量，指标成分单一、分析时间长[5-7]。超高效液相色谱法(UPLC)的快速发展为中药及中成药的分离分析提供了良好平台。本研究选择五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素、芦丁、齐墩果酸、槲皮素、山柰酚、熊果酸及太子参环肽B作为指标成分，利用超高效液相色谱仪同时进行含量测定，为提高肝复康丸质量控制水平及深入临床研究提供参考。

1 材料

H-Class型超高效液相色谱仪(包括QSM二元溶剂管理器、二极管阵列检测器、SM-FTN样品管理器、CH-A型柱温箱、Empower 3色谱工作站，Waters公司)；ABS-135S型电子天平(d=0.01 mg，瑞士梅特勒公司)；KQ500D型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器公司，功率：280 W，频率：40 kHz)。

对照品芦丁(批号：100080-201610，纯度：92.6%)、齐墩果酸(批号：110709-201607，纯度：91.7%)、槲皮素(批号：100081-201509，纯度：98.6%)、山柰酚(批号：110861-201611，纯度：95.5%)、熊果酸(批号：110742-201622，纯度：94.7%)、五味子醇甲(批号：110857-201714，纯度：99.9%)、五味子酯甲(批号：111529-201505，纯度：95.3%)、五味子甲素(批号：110764-201513，纯度：99.5%)、五味子乙素(批号：110765-201512，纯度：99.0%)均购自中国食品药品检定研究院；对照品太子参环肽B(批号：20170511，纯度：99.0%)购自成都瑞芬思生物科技有限公司；甲醇、乙腈均为色谱纯(默克公司)；其他试剂均为分析纯；水为娃哈哈纯净水。

经河南大学药学院王金梅教授鉴定五味子(批号：20180918，产地：辽宁)为木兰科植物五味子Schisandrachinensis(Turcz.)Ball.的果实；太子参(批号：20170724，产地：山东)为石竹科植物孩儿参Pseudostellariaheterophylla(Miq.) Pax ex Pax et Hoffm.的块根；白花蛇舌草(批号：20181107，产地：河南)为茜草科植物白花蛇舌草Oldenlandiadiffusa(Willd.) Roxb.的带根全草。

肝复康丸(规格：每10粒质量1 g)购自药店，共收集3个厂家13批的样品，S1～S4为A公司生产(批号分别为20180704、20180925、20181119、20181206)，S5～S7为B公司生产(批号分别为20180525、20180712、20181223)，S8～S13为C公司生产(批号分别为201712381、201801125、201804271、201805169、201809332、201911274)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Ecilipse C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)；流动相：乙腈(A)-0.05% 磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～2.7 min，3%A；2.7～6.0 min，3.0%～20.5%A；6.0～16.9 min，20.5%～64.0%A；16.9～18.0 min，64.0%A；18.0～23.0 min，64.0%～3.0%A)；流速：0.3 mL·min-1；检测波长：360 nm(0～3 min，芦丁；9～10 min，槲皮素；11～12 min，山柰酚)、210 nm(3～9 min，齐墩果酸；12～23 min，熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素)、203 nm(10～11 min，太子参环肽B)；柱温：30 ℃；进样量：3 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液的制备 精密称取对照品芦丁、齐墩果酸、槲皮素、太子参环肽B、山柰酚、五味子甲素、五味子乙素适量，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解定容，摇匀；精密称取对照品熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲，置10 mL量瓶中，用甲醇溶解定容，摇匀。分别精密量取上述2种混合对照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用60%乙醇定容，摇匀，即配制成含芦丁57.1 μg·mL-1、齐墩果酸79.3 μg·mL-1、槲皮素48.7 μg·mL-1、太子参环肽B 32.4 μg·mL-1、山柰酚43.6 μg·mL-1、熊果酸137.9 μg·mL-1、五味子醇甲188.3 μg·mL-1、五味子酯甲112.7 μg·mL-1、五味子甲素48.2 μg·mL-1、五味子乙素39.6 μg·mL-1的混合对照品溶液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.2供试品溶液的制备 取肝复康丸20丸，粉碎，称取细粉约1.0 g，精密称定，置100 mL锥形瓶中，加入60%乙醇50 mL，称定质量，室温超声处理(250 W，40 kHz)45 min，取出，放冷至室温，用60%乙醇补足损失质量，摇匀，15 200 r·min-1(离心半径为10 cm)离心5 min，取上清液经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.2.3阴性对照品溶液的制备 取五味子、太子参、白花蛇舌草，按肝复康丸处方比例制备缺五味子阴性对照品、缺太子参阴性对照品、缺白花蛇舌草阴性对照品，按2.2.2项下方法处理，即得相应的阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1专属性试验 分别精密吸取2.2项下的供试品溶液、混合对照品溶液和阴性供试品溶液各3 μL，按2.1项下色谱条件分别进样，得相应色谱图(图1)。结果对比对照品溶液色谱图，供试品溶液色谱图中10个有效成分在相应保留时间均有色谱峰，缺五味子阴性对照品色谱图在五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素保留时间处有相应色谱峰，缺太子参阴性对照品色谱图在太子参环肽B保留时间处无相应色谱峰，缺白花蛇舌草阴性对照品色谱图在芦丁、齐墩果酸、槲皮素、山柰酚、熊果酸保留时间处无相应色谱峰。供试品溶液色谱图中各色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度>1.5，理论板数按五味子醇甲计>12 000，拖尾因子均小于1.05，说明该色谱系统专属性较好。

注：A.混合对照品溶液；B.供试品溶液；C.缺白花蛇舌草阴性对照溶液；D.缺太子参阴性对照溶液；E.缺五味子阴性对照溶液；1.芦丁；2.齐墩果酸；3.槲皮素；4.太子参环肽B；5.山柰酚；6.熊果酸；7.五味子醇甲；8.五味子酯甲；9.五味子甲素；10.五味子乙素。图1 肝复康丸UPLC图

2.3.2线性关系考察 分别精密吸取2.2.1项下混合对照品溶液0.16、0.20、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00 mL，分别置于2 mL量瓶中，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，得系列混合对照品溶液。按2.1项下色谱条件分别进样3 μL，记录色谱图。以各成分的质量浓度(X)对峰面积(Y)进行线性回归，计算相应回归方程和相关系数，见表1。结果表明，各成分均有良好的线性关系。

表1 肝复康丸10个有效成分的回归方程及线性范围

取2.2.1项下混合对照品溶液，用甲醇倍比稀释，按2.1项下色谱条件进样3 μL，取各成分峰面积信噪比(S/N)为10时的混合对照品溶液质量浓度为定量限(LOQ)，结果芦丁、齐墩果酸、槲皮素、太子参环肽B、山柰酚、熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素LOQ分别为0.09、0.04、0.15、0.11、0.17、0.28、0.19、0.07、0.04、0.07 μg·mL-1。

2.3.3精密度试验 取混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件进样3 μL，连续进样6次。结果芦丁、齐墩果酸、槲皮素、太子参环肽B、山柰酚、熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素峰面积RSD分别为0.66%、0.57%、0.81%、0.32%、0.48%、0.39%、0.71%、0.69%、0.53%、0.40%，均符合仪器精密度要求。

2.3.4稳定性试验 取供试品溶液(批号：20180704)，分别于制备后0、4、8、16、20、24 h按2.1项下色谱条件进样3 μL。结果芦丁、齐墩果酸、槲皮素、太子参环肽B、山柰酚、熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素峰面积的RSD分别为2.41%、1.85%、1.26%、2.25%、2.07%、1.63%、1.90%、1.14%、2.13%、1.57%，表明供试品溶液24 h内稳定。

2.3.5重复性试验 取供试品细粉(批号：20180704)6份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样3 μL测定。结果样品中芦丁、齐墩果酸、槲皮素、太子参环肽B、山柰酚、熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素平均质量分数分别为1.142、1.586、0.973、0.647、0.871、2.758、3.765、2.254、0.963、0.791 mg·g-1，RSD分别为0.51%、0.92%、0.47%、0.38%、1.74%、0.95%、0.69%、1.22%、0.43%、1.56%，表明该方法重复性良好。

2.3.6加样回收率试验 取已知含量供试品(批号：20180704)细粉9份，每份约0.5 g，精密称定，分别置于100 mL锥形瓶中，分成3组，分别精密加入含芦丁(0.229 mg·g-1)、齐墩果酸(0.318 mg·g-1)、槲皮素(0.195 mg·g-1)、太子参环肽B(0.130 mg·g-1)、山柰酚(0.175 mg·g-1)、熊果酸(0.553 mg·g-1)、五味子醇甲(0.755 mg·g-1)、五味子酯甲(0.452 mg·g-1)、五味子甲素(0.193 mg·g-1)、五味子乙素(0.159 mg·g-1)的混合对照品溶液2.0、2.5、3.0 mL，按2.2.2项下方法处理，按2.1项下色谱条件进样3 μL，记录色谱图，计算各成分的平均加样回收率及其RSD，结果见表2。

表2 肝复康丸加样回收率试验结果

续表2

2.4 样品含量测定

取13批肝复康丸供试品，分别按2.2.2项下条件制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样3 μL，记录色谱图及峰面积，按外标法计算芦丁、齐墩果酸、槲皮素、太子参环肽B、山柰酚、熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素含量，每份样品重复测定3次，计算平均值，结果见表3。

表3 肝复康丸各成分含量测定结果(n=3) mg·g-1

2.5 聚类分析

利用SPSS 22.0软件[8-10]，以13批肝复康丸中10个有效成分含量为数据样本，采用组间均联法，以Euclidean距离平方为测度，进行系统聚类分析，结果见图2。根据聚类分析树状图，13批样品分成3大类：S1～S4为Ⅰ类，S5～S7为Ⅱ类，S8～S13为Ⅲ类。

图2 13批肝复康丸聚类分析

2.6 主成分分析

以13批肝复康丸中的10个成分含量为指标建立数据集，输入SPSS 22.0软件[11-15]，运用因子分析中的主成分分析处理，以特征值>1为提取主成分标准，共提取到A1和A22个主成分，累积方差贡献率达97.189%>85%，说明A1和A22个主成分可解释肝复康丸10个有效成分含量的97.189%，具有代表性。其中A1特征值为8.669，方差贡献率为86.693%，A2特征值为1.050，方差贡献率为10.496%。2个主成分的相关系数矩阵及因子得分矩阵见表4～5。由表4可知，芦丁、齐墩果酸、槲皮素、山柰酚和熊果酸之间均具有较大的正相关性，五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素之间均具有较大的正相关性。由表5因子得分矩阵可知，芦丁、齐墩果酸、槲皮素、太子参环肽B、山柰酚、熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素均对主成分A1的信息贡献较大。

表4 肝复康丸主成分分析10个成分相关系数矩阵

表5 肝复康丸主成分分析因子得分矩阵

以每个主成分的特征值占累加特征值的百分比作为权重系数进行线性组合，可得到综合得分。综合得分越高，说明以10个有效成分为指标的肝复康丸质量越好。由表6可知，C厂家产品质量较好。

表6 13批肝复康丸主成分得分、综合得分及排序

F=0.892F1+0.108F2

(1)

F代表综合得分，F1和F2分别代表2个主成得分，其中Fn=FACn×相应特征值的算术平方根(n代表主成分，FAC为主成分的因子得分系数)。

3 讨论

3.1 提取方法考察

本实验考察了超声、加热回流2种不同提取方法，结果无明显差异，故选择易于操作的超声提取法；考察乙醇、80%乙醇、60%乙醇和40%乙醇4种不同提取溶剂及30、45、60 min 3种不同提取时间，结果60%乙醇超声45 min时10个成分提取率较高，杂质影响较小，故以60%乙醇超声45 min为最终提取条件。

3.2 流动相的考察

本实验流动相考察了甲醇、乙腈作为有机相，0.05%甲酸、0.05%磷酸、0.1%磷酸作为水相，结果显示，乙腈为有机相时，在203 nm波段区基线较平稳，信号干扰小；以0.05%磷酸和0.1%磷酸作为水相时，各主要成分分离效果较好，但0.1%磷酸pH低于色谱柱的使用范围，故以乙腈-0.05%磷酸作为肝复康丸中10个成分的流动相系统，基线平稳，10个成分分离完全，保留时间适中，峰形较好，专属性强。

3.3 检验波长考察

本实验采用二极管阵列检测器，从190～400 nm波长全扫描，结果芦丁、槲皮素、山柰酚在350～360 nm波长段有最大吸收，齐墩果酸、熊果酸在210 nm处有最大吸收，五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素在210～245 nm波长段有最大吸收，太子参环肽B在203 nm处有最大吸收，为提高测定的专属性、准确度和灵敏度，本实验选择360 nm(0～3 min，芦丁；9～10 min，槲皮素；11～12 min，山柰酚)、210 nm(3～9 min，齐墩果酸；12～23 min，熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素和五味子乙素)、203 nm(10～11 min，太子参环肽B)的波长切换法测定肝复康丸中10个成分的含量。

3.4 液相色谱仪的考察

本实验分别考察HPLC和UPLC分析，结果UPLC相较HPLC不仅大大缩短了分析时间(由84 min缩短到23 min)，而且溶剂用量更少，降低了分析成本，各主要成分的分离效果更好，灵敏度和专属性更强，且测定结果准确、可靠，可用于肝复康丸的质量控制。

目前，关于肝复康丸中有效成分的含量测定文献资料较少，本研究建立了UPLC同时测量肝复康丸中的芦丁、齐墩果酸、槲皮素、太子参环肽B、山柰酚、熊果酸、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素10个成分的含量，经精密度、稳定性、重复性、加样回收率等方法学验证准确有效，可为肝复康丸药品质量评价提供参考。