丹参提取工艺过程中糖类成分变化趋势△

周立红，周梦鸽，齐敏超，杨哲萱，刘朋，章顺楠*，朱永宏，王涛

1.天津中医药大学，天津 300193；2.天士力医药集团股份有限公司 中药先进制造技术国家地方联合工程实验室，天津 300410

丹参是唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBunge的干燥根及根茎，具有活血化瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痛的功效[1]。丹参提取物能够从心肌缺血的不同阶段发挥保护作用[2]，可以降低心肌缺血诱导因子的产生[3]、舒张血管[4]、提高心肌代谢效率[5]、降低心肌细胞凋亡率，达到保护受损心肌的作用[6]。

《药品生产质量管理规范》(GMP)2010年版明确指出，中药制剂的质量与中药提取工艺密切相关，因而，对中药提取过程建立过程控制标准、提高批次间质量一致性是保证中药产品质量提升的关键点之一。水提液醇沉工艺是中药提取精制的传统手段，较高的乙醇体积分数可以去除蛋白质、鞣质、水溶性色素等杂质，还包括大分子的多糖类成分[7]。丹参提取物是丹参药材经水提醇沉多道工序得来的中成药原料。已知糖类成分总量占丹参提取物总量的50%左右，经过高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)分析表明，其中糖类成分相对分子质量在2000以下，属于单糖和低聚糖[5]。糖类成分在整个提取工艺过程中总量占比最高，性质相对稳定，因而对提取工艺过程中糖类成分变化趋势的研究，有助于加深对提取工艺过程的理解，提高工艺控制水平。

糖类成分的含量检测方法有苯酚-浓硫酸的比色法、柱前衍生化法、HPLC-示差检测器法、高效液相色谱-蒸发光散射检测法(HPLC-ELSD)等。其中，苯酚-硫酸法专属性较差，而且只能做总糖测定，不能测定糖类成分组成[8]；柱前衍生化法操作步骤繁琐[8]；示差折光检测器的灵敏度低、平衡时间长[9]；HPLC则用时较长[10]。本研究建立了超高效液相色谱-蒸发光散射检测法(UPLC-ELSD)，采用Waters UPLC-BEH amide色谱柱，有效去除其他物质干扰，在15 min内完成对丹参提取物中果糖、葡萄糖、蔗糖、棉子糖、水苏糖5种糖的含量测定，该方法更加简便、快捷。

1 材料

1.1 仪器

Waters超高效液相色谱仪，包括蒸发光检测器(ELSD)、Empower 3 化学工作站等；XS205型电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)。

1.2 试药

标准品果糖(批号：059K00681V，纯度：100%)、葡萄糖(批号：059K00681V，纯度：99.5%)、蔗糖(批号：090M02112V，纯度：99.5%)、棉籽糖(批号：BCBH6893V，纯度：99%)、水苏糖(批号：MKBL6314V，纯度：98%)均购于Sigma公司；乙腈(默克公司，色谱纯)；三乙胺(Sigma公司，纯度：99.5%)；甲醇[利安隆博华(天津)医药化学有限公司，分析纯]；水为实验室自制。

丹参提取物(丹参素质量分数≥3%)由天士力医药集团股份有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 检测方法

色谱条件：ACQUITY UPLC BEH Amide色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；柱温：35 ℃；样品室温度：20 ℃；流动相：乙腈-水(67∶33，含0.2%三乙胺)；流速：0.11 mL·min-1；进样量：1 μL。蒸发光检测器增益：200；载气压力：241.316 Pa；漂移管温度：50 ℃；雾化器参数65%。

对照品溶液的制备：取果糖约0.080 g、葡萄糖约0.050 g、蔗糖约0.360 g、棉子糖约0.088 g、水苏糖约1.000 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，摇匀。取5 mL置25 mL量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液。精密量取上述对照品储备液3 mL，置10 mL量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，摇匀，得对照品混合溶液1。精密量取上述对照品储备液7 mL，置10 mL量瓶中，加纯化水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品混合溶液2。

供试品溶液的制备：精密称取丹参提取物约0.4 g，置10 mL量瓶中，加纯化水适量，超声使溶解，放冷，定容至刻度，摇匀，精密量取2 mL上至已处理好的固相萃取小柱[Cleanert PS-SPE，1000 mg·(6 mL)-1，甲醇20 mL，水20 mL活化]，用纯化水以0.1 mL·min-1的速度洗涤，收集全部洗脱液至10 mL量瓶，加纯化水至刻度，摇匀，即得。

测定法：将供试品溶液和对照品混合溶液1、对照品混合溶液2分别进样1 μL，见图1，采用外标两点法计算供试品中各成分含量。

注：A.对照品；B.供试品；1.果糖；2.葡萄糖；3.蔗糖；4.棉子糖；5.水苏糖。图1 对照品及丹参提取物糖成分色谱图

外标两点法对数方程：Y=KX+b，其中，Y=lgC，X=lgA。

(1)

式中，K为外标两点法对数方程斜率；A为峰面积；b为外标两点法对数方程截距；W为称样量。

2.2 样品含量测定

应用所建立的UPLC-ELSD，测定19批不同年份生产规模的丹参提取物糖类成分含量。从表1中数据可以看出，丹参提取物中含量最高的寡糖成分是水苏糖(四糖)，其次是蔗糖、果糖、葡萄糖和棉子糖，且各个样品中5种糖类成分含量差异较小。

表1 丹参提取物糖类组分含量测定结果 %

2.3 提取过程中糖类成分转移率

取3个不同批次的丹参提取工艺过程中间体(提取液、浓缩液、醇沉上清液、稀浸膏)，按照2.1项下方法测定各个样品的5种糖类成分含量，并通过每个工艺节点总量计算各糖类成分质量分数(表2)，同时计算提取工艺中各工序糖类成分的转移率(各工序所测糖总量与提取工序获得相应糖总量百分比)，结果见图2。

表2 丹参提取工艺过程中间体糖类成分质量分数 %

图2 糖类成分在提取过程中的转移率

数据结果分析发现，在提取工艺过程中不同批次的糖类成分的变化趋势一致，总量均为明显下降趋势，而且在醇沉工序下降幅度最大，见图2。在醇沉工序糖类成分转移率与相对分子质量关系直观图可以看出(图3)，单糖(果糖、葡萄糖)、二糖(蔗糖)转移率相当，分别为38.51%、36.41%、34.92%；但随着相对分子质量的增加，转移率下降明显，其中水苏糖(四糖)的转移率最低，平均仅为12.06%。

图3 不同相对分子质量糖成分醇沉工序转移率

2.4 醇沉方式对糖类成分转移率影响

由于醇沉工序是影响糖成分的关键步骤，因此，醇沉方式也可能影响醇沉效果，从而影响终产品的质量一致性。考察2种醇沉方式对丹参提取物糖成分含量的影响，一种为以表观醇度判定终点法，即少量逐次加入乙醇；另一种方式为通过计算一次性倍量加入乙醇，两者乙醇加入总量相当。分别对30批次丹参提取物5种糖含量进行检测。组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)并以t检验。统计结果见表3，两者总糖含量差异有统计学意义(P<0.001)，平均质量分数分别为39.92%、34.44%；其中，果糖(单糖，P<0.01)和水苏糖(四糖，P<0.001)2种成分含量差异有统计学意义，以表观醇度判定终点法为醇沉方式得到的提取物中水苏糖含量较高，而倍量乙醇加入法果糖含量较高。总体上，倍量乙醇加入法的组内差异RSD较小。2种醇沉方式各批次提取物糖含量分布见图4。

表3 不同醇沉方式对丹参提取物中糖成分含量影响 %

图4 不同醇沉方式对多批次丹参提取物糖成分含量分布的影响

3 讨论

多个生产批次含量考察结果可以看出，丹参提取物中糖类成分含量波动较小；提取物总量与糖类成分总量进行相关性分析，结果相关性在0.9以上。且5种糖类成分在丹参提取工艺过程中均表现稳定，尤其是水苏糖含量最高，因此其能够很好地作为提取工艺过程质量一致性的表征。

在提取工艺过程中间体的糖类成分研究中发现，多批次样品糖类成分在整个提取工艺过程中变化一致，整体呈下降趋势，醇沉过程下降最为明显，表明醇沉工序是影响糖含量的关键工序。很多研究已表明，醇沉醇度与糖类成分转移率相关性最强，与相对分子质量呈反比[11]；即醇沉工艺能够用以去除大相对分子质量的糖类成分。这对纯化中药有效成分、提高治疗效果及揭示药效物质基础、确保质量一致性至关重要[12]。本研究中糖成分转移率与相对分子质量分布情况也验证了上述趋势，小相对分子质量的单糖、二糖转移率相当，三糖、四糖则随着相对分子质量的增加转移率趋于降低，且下降明显，这与糖在介质中溶解度差异有很大的关系[13]。

本研究醇沉方式考察也表明，不同方式影响不同相对分子质量糖成分的转移率，而水苏糖相对分子质量最大，含量也最高，显示了与总糖含量与波动一致性现象。再者，即使加醇量一致，不同的放入方式也会影响总糖与单成分的含量和波动，这与过程中温度、工序时间及过程中成分在料液中的溶解行为有关，应该综合考虑工艺参数的设计以提高工艺过程控制能力[14]；糖类成分可以作为醇沉工艺控制能力的表征。