基于HPLC指纹图谱的60Co-γ辐射灭菌对虎杖有效成分的影响研究

丁伟，何洁，黄东萍，緱慧君

陕西省汉中市食品药品监督检验检测中心，陕西 汉中 723000

虎杖为蓼科植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.的干燥根茎和根，具有利湿退黄、清热解毒、散瘀止痛、止咳化痰之功效，主产于江西、四川、山东、江苏等地，中医临床用于治疗湿热黄疸、淋浊、带下、风湿痹痛、痈肿疮毒、水火烫伤、跌打损伤、肺热咳嗽等。其主要活性成分为蒽醌类、二苯乙烯类、苯丙素类及黄酮类等[1-3]。槲皮素是黄酮类抗氧化剂和自由基清除剂，对卵巢衰老有保护作用，可提高卵巢的抗氧化能力，同时具有抗肿瘤活性[4-5]。虎杖苷和白藜芦醇是二苯乙烯类化合物，可改善心肌损伤，具有保护血管、调血脂、抗血栓等作用[6-7]。大黄素和大黄素甲醚是蒽醌类化合物，大黄素对急性髓系白血病细胞有抑制作用[8]；大黄素甲醚对人体黑色素瘤、乳腺癌抑制作用较强[9-10]。

60Co-γ辐射灭菌是通过特定的方式控制微生物生长或杀死微生物的一种灭菌方法，广泛应用于中药饮片和中成药的生产灭菌，相比传统灭菌方法具有穿透力强、灭菌效果好、经济安全、无辐照残留等优点，尤其适用于热敏性物料及挥发性成分的灭菌[11-13]。中药一般来源于天然植物、动物及矿物，微生物含量高，灭菌是中药生产过程中的重要环节。中药成分具有复杂性和多样性，因此在保证药品“安全、有效、稳定”的原则下，如何因药制宜地选择灭菌方式尤为重要。60Co-γ辐照是中药灭菌的辅助手段。为加强中药辐照灭菌质量管理，原中华人民共和国卫生部于1997年颁布了《60Co辐照中药灭菌剂量标准》(内部试行)，并列出198种允许辐照灭菌的中药、5种允许低剂量(3 kGy)辐照灭菌药材品种、2种不允许辐照的药材品种及70种允许辐照的中成药品种，原则上未列入名录的品种不允许辐照灭菌。2015年11月9日原国家食品药品监督管理局颁布了《中药辐照灭菌技术指导原则》(以下简称《指导原则》)，规定中药采用辐照灭菌应充分系统说明其必要性。《中华人民共和国药典》2020年版规定“不受辐射破坏的原料药及成品”列入可辐照的范围。虎杖作为传统中药，临床应用广泛，因此虎杖饮片及以虎杖原料生粉入药的制剂如疏风活络丸，在生产中仍存在辐照灭菌的需求，但虎杖及含虎杖制剂并未列入《60Co辐照中药灭菌剂量标准》允许辐照灭菌的中药品种名录，且尚未发现有关采用60Co-γ辐照灭菌虎杖药材的研究报道。因此，为考察60Co-γ辐照对虎杖灭菌的可行性，本研究采用高效液相色谱法(HPLC)建立虎杖指纹图谱，并定量分析槲皮素、虎杖苷、白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚5个成分含量，考察不同辐照剂量对其的影响，以期为虎杖及相关制剂采用60Co-γ辐照灭菌提供参考。

1 材料

1.1 仪器

LC-20AT型高效液相色谱仪[包括四元泵、二极管阵列检测器(DAD)，日本岛津公司]；CPA225D型电子天平(0.01 mg，德国赛多利斯公司)；60Co-γ射线辐照设备(咸阳华科辐照技术有限公司)；KQ-800E型数控超声波清洗器(昆山超声波仪器有限公司，功率：250 W，频率：40 kHz)；FW100型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2 试药

对照品虎杖苷(批号：11575-201603，纯度：87.36%)、槲皮素(批号：100081-201509，纯度：98.6%)、大黄素(批号：110756-201512，纯度：98.7%)、大黄素甲醚(批号：110758-201817，纯度：99.2%)均购自中国食品药品检定研究院；对照品白藜芦醇(批号：150122，纯度≥98%)购自成都克洛玛生物科技有限公司；甲醇、乙腈为色谱纯，美国天地有限公司；水为娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯。

虎杖饮片为市售，购于安徽亳州药材市场，批号分别为20170512、20170619、20170625、20170922、20170930、20171104、20180514、20180528、20180610、20180722、20181011、20181017、20181104、20181127、20190527，编号S1～S15。《指导原则》规定中药60Co-γ射线辐射灭菌剂量应不大于10 kGy，故分别以0(样品编号S1～S15)、3(处理后样品编号为S16～S30)、6(处理后样品编号为S31～S45)、10(处理后样品编号为S46～S60)kGy剂量辐照处理样品。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1混合对照品溶液的制备 精密称取对照品槲皮素、虎杖苷、白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚适量，以甲醇为溶剂配制成质量浓度分别为214.2、523.3、359.2、704.2、439.2 μg·mL-1的混合对照品溶液，经0.45 μm的微孔滤膜滤过，备用。

2.1.2供试品溶液的制备 取虎杖药材约10 g，粉碎，过二号筛，取细粉约1.0 g，精密称定，置100 mL具塞锥形瓶中，加入甲醇溶液30 mL，密塞并精密称定，超声1 h(功率为250 W；频率为40 kHz；水温为30 ℃)，放冷至室温，用甲醇补足减少的质量，摇匀，静置，取上清液，经0.45 μm的微孔滤膜滤过，备用。

2.2 色谱条件及系统适用性检测

色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈(A)-0.05%磷酸溶液(B)，梯度洗脱(0～7 min，6%A；7～21 min，6%～13%A；21～30 min，13%～45%A；30～48 min，45%～60%A；48～56 min，60%A；56～60 min，60%～6%A；60～63 min，6%A)；检测波长：254、303 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：20 μL[14-16]。取2.1.1项下混合对照品溶液20 μL，注入液相色谱仪，按上述色谱条件分析。结果表明，各色谱峰与相邻色谱峰之间分离度均大于1.5，理论塔板数按虎杖苷计>5000，连续进样5针，各组分色谱峰峰面积的RSD均小于2.0%，系统适用性良好。

2.3 HPLC指纹图谱研究

2.3.1精密度试验 取虎杖药材粉末(S1)，精密称定，按2.1.2项下供试品溶液方法处理，按2.2项下色谱条件分析，连续进样6次，记录色谱图。以8号色谱峰为参照峰，计算各共有峰的相对峰面积及相对保留时间RSD均小于1.53%，表明仪器精密度良好。

2.3.2稳定性试验 取虎杖药材粉末(S1)，按2.1.2项下供试品溶液方法处理，分别放置0、4、8、16、24、48 h，按2.2项下色谱条件分析，记录色谱图。以8号色谱峰为参照峰，计算各共有峰的相对峰面积及相对保留时间RSD均小于2.74%，表明供试品溶液在室温条件下48 h内稳定。

2.3.3重复性试验 取虎杖药材粉末(S1)6份，每份约1.0 g，精密称定，按2.1.2项下方法制备供试品溶液6份，按2.2项下色谱条件分析，记录色谱图。以8号色谱峰为参照峰，计算各共有峰的相对峰面积及相对保留时间RSD均小于2.33%，表明方法重复性良好。

2.3.4虎杖指纹图谱的建立 取60批经0、3、6、10 kGy辐照处理的虎杖供试品适量，按2.1.2项下供试品溶液方法处理，按2.2项下色谱条件分析，记录色谱图。分别将不同剂量处理的15批色谱图导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)软件，建立指纹图谱，设置时间窗为0.5 min，采用中位矢量法多点校正，全谱段峰匹配，生成对照图谱。指纹图谱及共有模式见图1。

图1 不同剂量辐照虎杖HPLC指纹图谱

2.3.5指纹图谱共有峰指认及相似度评价 经0、3、6、10 kGy辐照处理的虎杖指纹图谱中可确定13个色谱峰为虎杖共有指纹峰，与2.1.1项下对照品比对，确认峰4为槲皮素、峰7为虎杖苷、峰8为白藜芦醇、峰11为大黄素、峰13为大黄素甲醚。其中，8号峰白藜芦醇与相邻色谱峰分离度较好，保留时间居中且稳定，故以8号峰白藜芦醇为参照峰。

将不同辐照剂量下的虎杖药材指纹图谱导入“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”(2012版)软件，以0 kGy辐照样品图谱作为参照图谱，设置时间窗为0.5 min，采用中位矢量法多点校正，全谱段峰匹配，生成对照图谱，计算各图谱与对照指纹图谱的相似度，结果见表1。由表1可知，样品相似度均为0.803～1.000，表明虎杖药材在4种辐照剂量下整体稳定性较好，指纹图谱无色谱峰丢失或增加。

表1 不同剂量辐照虎杖HPLC指纹图谱相似度

2.4 虎杖中5个成分定量分析

2.4.1系统适用性考察 分别精密吸取混合对照品溶液、虎杖供试品溶液(S1)、空白溶液各20 μL，按2.2项下色谱条件测定，记录色谱图。结果，理论塔板数按虎杖苷色谱峰计>5000；槲皮素、虎杖苷、白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚色谱峰与相邻色谱峰之间分离度均大于1.5，5个化学成分对称因子均在0.95～1.05，表明该方法专属性良好。色谱图见图2。

注：A.混合对照品；B.供试品；C.空白溶剂；4.槲皮素；7.虎杖苷；8.白藜芦醇；11.大黄素；13.大黄素甲醚。图2 虎杖样品及对照品HPLC图

2.4.2线性关系考察 精密量取混合对照品溶液0.2、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 mL，分别置10 mL量瓶中，分别用甲醇稀释成含槲皮素质量浓度分别为4.28、21.42、42.84、85.68、171.36、214.20 μg·mL-1，虎杖苷质量浓度分别为10.47、52.33、104.66、209.32、418.64、523.30 μg·mL-1，白藜芦醇质量浓度分别为7.18、35.92、71.84、143.68、287.36、359.20 μg·mL-1，大黄素质量浓度分别为14.08、70.43、140.84、281.68、563.36、704.20 μg·mL-1，大黄素甲醚质量浓度分别为8.78、43.92、87.84、175.68、351.36、439.20 μg·mL-1的系列混合对照品溶液，摇匀，按2.2项下色谱条件分析，记录色谱图。以各对照品质量浓度为横坐标(X)，色谱峰峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，并计算相关系数。取混合对照溶液，甲醇作为稀释溶剂，配制不同质量浓度混合对照品溶液，按2.2项下色谱条件分析，取信噪比(S/N)=10时的质量浓度为定量限，S/N=3时的质量浓度为检测限(LOD)。结果见表2。

表2 虎杖中5个成分线性回归方程

2.4.3精密度试验 取2.1.2项下供试品溶液(S1)，按2.2项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。结果槲皮素、虎杖苷、白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚峰面积RSD分别为0.28%、0.12%、0.43%、0.20%、0.15%，表明仪器精密度良好。

2.4.4稳定性试验 取2.1.2项下虎杖供试品(S1)溶液，分别放置0、4、8、16、24、48 h，按2.2项下色谱条件分析，记录色谱图。结果表明，槲皮素、虎杖苷、白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚峰面积的RSD分别为0.66%、0.78%、0.54%、0.93%和0.82%，供试品溶液在室温条件下48 h内稳定。

2.4.5重复性试验 取虎杖供试品(S1)6份，按2.1.2项下供试品溶液制备方法处理，按2.2项下色谱条件分析，记录色谱图。结果表明，槲皮素、虎杖苷、白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚的质量分数平均值分别为2.57、6.28、4.31、8.45、5.27 mg·g-1，RSD分别为1.15%、0.74%、1.52%、1.36%、1.41%，结果表明方法重复性良好。

2.4.6加样回收率试验 取虎杖供试品(S1)9份，每份约0.5 g，分为3组，每组3份，精密称定，每组按槲皮素、虎杖苷、白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚含量的80%、100%和120%精密加入对照品，按2.1.2项下供试品溶液制备方法处理，按2.2项下色谱条件分析，记录色谱图并计算各有效成分加样回收率。结果见表3。

表3 虎杖中5个成分的加样回收率试验结果

2.4.7样品测定 分别取15批经0、3、6、10 kGy剂量辐照处理的虎杖供试品，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件分析，记录色谱图，计算5个成分含量，结果见表4。

表4 虎杖中5个成分含量测定结果 mg·g-1

3 讨论

3.1 辐照剂量的选择

本研究考察60Co-γ辐照灭菌对虎杖其指纹图谱及化学成分的影响，参考《指导原则》建议中药最大总体平均辐照灭菌剂量原则上不得超过10 kGy及尽可能采用低剂量辐照灭菌的原则，选定3、6、10 kGy 3个剂量对虎杖进行辐照处理。结果表明，经不同剂量辐照处理后的虎杖样品指纹图谱共有峰数量没有变化；经3、6 kGy辐照处理后的样品指纹图谱与对照指纹图谱相似度均大于0.96，而经10 kGy辐照处理后的样品指纹图谱与对照指纹图谱的相似度平均值仅为0.829；采用SPSS 22.0软件对5个化学成分的含量采用独立样本t检验分析，分别比较5个化学成分经3、6、10 kGy辐照灭菌后与未辐照灭菌样品的含量差异是否具有统计意义。结果显示，辐照剂量为6 kGy及以下时5个化合物含量差异无统计学意义，当剂量达到10 kGy时，大黄素甲醚平均含量较0 kGy时降低8.33%(P<0.05)。大黄素甲醚是蒽醌类成分，分子结构中含有苯甲氧基，在γ射线的作用下易发生氢化反应，降低了抗辐照稳定性[17]。

3.2 色谱条件的优化

分别考察了乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-水溶液、甲醇-0.05%磷酸溶液3种流动相系统，结果表明，乙腈-0.05%磷酸溶液基线平稳、色谱峰丰富、分离效果好，因此确定乙腈-0.05%磷酸溶液梯度洗脱为虎杖指纹图谱及5个化学成分检测的流动相。采用DAD检测器在190～400 nm全波长扫描，结果表明，槲皮素、虎杖苷和白藜芦醇在303 nm处、大黄素和大黄素甲醚在254 nm处有最大吸收，因此采用303 nm(0～35 min)、254 nm(35～63 min)不同时段波长切换法作为虎杖指纹图谱分析及5 个成分含量测定的检测波长。

4 结论

本研究建立的指纹图谱及含量测定方法经方法学验证，可用于分析不同辐照灭菌剂量虎杖药材指纹图谱和槲皮素、虎杖苷、白藜芦醇、大黄素、大黄素甲醚5个化学成分含量测定。研究结果显示，60Co-γ辐照灭菌剂量不超过6 kGy，对虎杖药材指纹图谱和5个化合物含量影响差异无统计学意义，可为虎杖采用60Co-γ辐照灭菌可行性提供理论参考。