西红花花瓣中氨基酸与微量元素等成分含量研究

吕卓，袁文婷，汤迪，濮存海

1.陕西省食品药品监督检验研究院，陕西 西安 710065；2.延边大学 药学院，吉林 延吉 133000；3.上海优耕农业科技有限公司，上海 200000；4.中国中药协会 中药新技术专委会，江苏 南京 210008

西红花CrocussativusL.又名藏红花，药用部位为花的柱头，具有活血化瘀等作用[1]。其产量较低，90朵花能得到1 g左右的干燥柱头，副产物花瓣都被丢弃[2]。西红花非药用部位的药理作用和化学成分也多有报道。现代药理研究表明，西红花非药用部位具有抗氧化作用[3-5]、抗真菌与细胞毒作用[6]、心血管系统保护作用[7]、肝脏和肾脏保护作用[8]等。文献研究表明，西红花非药用部位中含有多种化学成分。王晓萌等[9]采用气相色谱-质谱法(GC-MS)分析西红花花瓣和雄蕊中的挥发油成分，在花瓣中鉴定出16个化合物，雄蕊中鉴定出20个化合物。高文运等[10]从西红花侧芽中分离得到4个蒽醌类化合物。宋纯清[11]从西红花的花被中分离出5个黄酮醇类化合物。除此之外，西红花非药用部位中还含酚酸类[12]和西红花酸类[13]等成分。氨基酸、蛋白质、微量元素在人体生命过程中发挥重要的作用。蛋白质是生命的物质基础，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。氨基酸可以提高人体免疫力，维持正常代谢水平。部分氨基酸还可以发挥健脑、调节血压、促进生长和发育等作用。微量元素不仅是人体的必要组分，还充当酶的激活剂、催化剂等角色。目前，西红花花瓣中氨基酸、蛋白质、微量元素等成分研究较少。本研究分别测定了西红花花瓣中氨基酸、蛋白质和微量元素的含量，为西红花的综合利用提供参考。

1 材料

1.1 试药

西红花柱头及花瓣样品由上海优耕农业科技有限公司提供，经江苏省药品检验研究院胡浩彬主任药师鉴定为鸢尾科植物番红花CrocussativusL.的柱头及花瓣。将西红花花瓣及残留的柱头经冷冻干燥后，以挑选出残剩柱头的花瓣(挑选)和未经挑选柱头的花瓣(未挑选)作为研究样品。

16种氨基酸混合标准溶液[天冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)，批号：SLBT4982，浓度均为2.5 μmol·mL-1，西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司]；多元素混合标准物质溶液[硼(B)、钛(Ti)、钒(V)、铬(Cr)、锰(Mn)、铁(Fe)、钴(Co)、镍(Ni)、铜(Cu)、锌(Zn)、砷(As)、硒(Se)、锶(Sr)、钼(Mo)、镉(Cd)、锡(Sn)、锑(Sb)、钡(Ba)、汞(Hg)、铊(Tl)、铅(Pb)，批号：GNM-M25748-2013(17D5090)，质量浓度均为100 μg·mL-1]、钾(K)单元素标准物质溶液(批号：GSB 04-1733-2004，质量浓度：1000 μg·mL-1)均购于国家有色金属及电子材料分析测试中心；钠(Na)单元素标准物质溶液[批号：GBW(E)080127，质量浓度：1000 μg·mL-1]、镁(Mg)单元素标准物质溶液[批号：GBW(E)080126，质量浓度：1000 μg·mL-1]、铝(Al)单元素标准物质溶液[批号：GBW(E)080219，质量浓度：1000 μg·mL-1]、钙(Ca)单元素标准物质溶液[批号：GBW(E)080118，质量浓度：1000 μg·mL-1]均购于中国计量科学研究院；内标多元素混合标准溶液[批号：IS7B17D1，其中含有铋(Bi)、镓(Ga)、铟(In)、锂(Li)、钪(Sc)、铽(Tb)、钇(Y)，质量浓度均为100 μg·mL-1，Reagecon公司]；生物成分分析标准物质-黄芪样品[批号：GBW10028(GSB-19)，地球物理地球化学勘察研究所]；婴儿配方乳粉中蛋白质、脂肪、乳糖定量分析质控样品(批号：QC-IP-709，中国检验检疫科学研究院测试评价中心)。

盐酸(分析纯)、双氧水(优级纯)、硫酸钾(分析纯)、硫酸铜(分析纯)、硫酸(分析纯)、硼酸(分析纯)、氢氧化钠(分析纯)均购于国药集团化学试剂有限公司；硝酸(优级纯，德国Merck公司)；水为GB/T 6682规定的一级水。

1.2 仪器

L-8900型氨基酸分析仪(日立仪器有限公司)；7800型电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS，安捷伦科技有限公司)；Mars6型微波消解仪(美国CEM公司)；K-360型全自动凯氏定氮仪(瑞士Buchi有限公司)；AE-240型电子分析天平(精度为0.1 mg，瑞士Mettler-Toledo公司)。

2 方法与结果

2.1 氨基酸的测定

2.1.1分析条件 磺酸型阳离子树脂色谱柱，检测波长分别为570、440 nm[14]。

2.1.2供试品溶液的制备 分别称定研细混匀后的西红花花瓣(挑选)、西红花花瓣(未挑选)及西红花柱头约1 g，置耐压螺盖玻璃试管中，加入6 mol·L-1盐酸溶液10 mL，置减压干燥器中抽真空，充入氮气，重复抽真空-充入氮气3次后，在充氮状态下拧紧螺丝盖。将耐压螺盖玻璃试管放在110 ℃下水解22 h后，取出，冷却至室温。将水解液转移至25 mL量瓶中，用少量水润洗试管3次，润洗液移入同一量瓶内，水定容至刻度，摇匀。精密吸取上述溶液1 mL置15 mL离心管中，于45 ℃下氮气吹干，残渣用水溶解并定容于10 mL量瓶，摇匀，精密吸取3 mL置于10 mL量瓶，用水稀释并定容至刻度，经0.22 μm微孔滤膜滤过，供测定。

2.1.3标准品溶液的制备 取浓度均为2.5 μmol·L-1的混合标准品溶液1 mL，定容至10 mL，作为标准品中间使用液。再精密吸取上述标准品中间使用液0.25、0.50、1.50、2.00、2.50 mL分别置于5 mL量瓶中，用水稀释并定容至刻度，摇匀，即得。

2.1.4方法学考察

2.1.4.1线性关系考察 分别将2.1.3项下标准曲线工作溶液注入氨基酸分析仪，进样量20 μL，以峰面积为纵坐标(Y)，氨基酸浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，计算回归方程、相关系数(r)以及线性范围，线性关系良好，见表1。

表1 氨基酸标准曲线

2.1.4.2精密度试验 取2.1.3项下对照品中间使用液，注入氨基酸分析仪，重复测定6次，进样量20 μL，计算各氨基酸峰面积的RSD。结果表明，Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg和Pro峰面积的RSD分别为0.26%、0.21%、0.15%、0.11%、0.19%、0.25%、0.30%、0.18%、0.24%、0.17%、0.28%、0.15%、0.13%、0.16%、0.24%和0.12%，表明仪器精密度良好。

2.1.4.3重复性试验 取西红花柱头，按照2.1.2项下方法平行制备6份供试品溶液，注入氨基酸分析仪，计算氨基酸含量及RSD，结果表明，Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Val、Met、Ile、Leu、Tyr、Phe、Lys、His、Arg和Pro峰面积的RSD分别为2.31%、2.26%、3.09%、1.55%、3.16%、5.32%、4.57%、7.11%、4.13%、2.48%、4.49%、3.42%、6.74%、3.02%、3.91%和1.08%，表明该方法的重复性良好。

2.1.4.4加样回收率试验 取西红花柱头，称取6份样品，添加0.25 μmol·mL-1氨基酸混合标准品溶液一定体积，按照2.1.2项下方法平行制备6份供试品溶液，加样回收率为85.8%～97.8%，RSD为0.77%～4.52%，表明回收率和精密度符合要求。

2.1.5样品氨基酸含量测定结果 按照2.1.2项下分别对西红花花瓣(挑选)、西红花花瓣(未挑选)及西红花柱头进行氨基酸测定，见表2。从实验数据可以看出三者氨基酸含量较为接近。

表2 西红花花瓣与柱头氨基酸质量分数(n=3) g·kg-1

2.2 元素测定

2.2.1ICP-MS测定条件 射频功率1500 W；等离子体气流量15 L·min-1；采样锥：镍；雾化室温度：2 ℃；样品提升速率：0.3 r·s-1；雾化器：同心雾化器；采集方式：跳峰；分析模式：碰撞反应池[15]。

2.2.2供试品溶液的制备 称取研细混匀样品约0.25 g，置消解罐中，加入硝酸5 mL，进行预消解，预消解完成后再加入双氧水2 mL，置微波消解仪进行消解，消解完成后冷却，并进行赶酸，赶酸完成后用纯化水将消解液转移至10 mL量瓶中，上机测定时再精密吸取上述样品溶液1 mL置100 mL量瓶中，用纯化水稀释并定容至刻度，过0.22 μm微孔滤膜后上机测定。

2.2.3标准品溶液的制备 分别取多元素混合标准物质溶液0.1 mL及Na、Mg、Al、K、Ca单元素标准物质溶液各0.01 mL置于50 mL量瓶中，用5%硝酸稀释并定容至刻度，摇匀，制成多元素混合标准品溶液储备液。取上述多元素混合标准品溶液储备液2.5 mL置50 mL量瓶中，用5%硝酸溶液稀释并定容至刻度，摇匀，制成多元素混合标准品溶液使用液(1)。准确移取多元素混合标准品溶液使用液(1)5.0、2.0、1.0、0.5 mL置于10 mL量瓶中，用5%硝酸稀释并定容至刻度，摇匀，制成多元素混合标准品溶液使用液(2)～(5)，作为系列标准曲线溶液。

2.2.4内标多元素溶液配制 取内标多元素混合标准溶液0.1 mL置于50 mL量瓶中，用5%硝酸溶液稀释并定容至刻度，摇匀，制成内标多元素混合标准品溶液储备液。取内标多元素混合标准品溶液储备液5 mL置于20 mL量瓶中，用5%硝酸稀释并定容至刻度，摇匀，制成内标多元素混合标准品溶液使用液。Bi、Ga、In、Tb、Y质量浓度均为10 ng·mL-1，Li、Sc质量浓度均为50 ng·mL-1。

2.2.5空白溶液制备 除不称定样品外，其余同2.2.2项下制备空白样品溶液。

2.2.6方法学考察

2.2.6.1线性关系考察 分别将上述多元素标准曲线溶液注入电感耦合等离子体质谱仪，以待测元素与内标元素信号强度的响应比率为纵坐标(Y)，元素质量浓度为横坐标(X)，绘制标准曲线，计算回归方程、r及线性范围，线性关系良好。结果见表3。

表3 26种元素标准曲线

2.2.6.2精密度试验 取2.2.3项下多元素混合标准品溶液使用液(3)，注入电感耦合等离子体质谱仪，重复测定11次，以待测元素与内标元素的信号强度的响应比率计算RSD。结果表明，26种元素(B、Na、Mg、Al、K、Ca、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr、Mo、Cd、Sn、Sb、Ba、Hg、Tl和Pb)的RSD分别为4.64%、2.99%、3.06%、5.12%、4.82%、2.82%、4.77%、4.91%、4.36%、6.68%、4.52%、2.25%、2.36%、3.47%、3.93%、2.62%、3.93%、2.06%、3.82%、2.34%、3.60%、2.21%、3.44%、2.87%、4.45%、2.43%，表明仪器精密度良好。

2.2.6.3加样回收率试验 取元素质控样，按照2.2.2项下方法平行制备2份供试品溶液，按2.2.1项下条件进样检测。结果表明，26种元素(B、Na、Mg、Al、K、Ca、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Sr、Mo、Cd、Sn、Sb、Ba、Hg、Tl和Pb)质量分数分别为16.91、1 410.12、2 211.13、1 912.24、6 903.15、4 711.42、19.31、2.32、1.90、32.33、1 091.24、0.42、2.21、7.94、21.93、0.53、0.05、0、5.13、0.04、0、0.05、19.64、0.06、0.05、1.51 mg·kg-1，测得量与标准物质的标准值比较后，均在范围内，结果表明该方法的准确度符合要求。

2.2.7样品元素含量测定 按照参考文献[15]方法，分别对挑选后的西红花花瓣及柱头中26种元素进行测定。结果表明，3种试样中元素含量由高到低顺序为K、Mg、Fe、Al、Ca、Mn(表4)。

表4 西红花花瓣和柱头元素测定结果(n=3) mg·kg-1

2.3 蛋白质测定

2.3.1检测参数 自动凯氏定氮仪蒸汽输出90%[16]。

2.3.2供试品溶液制备 取混匀的供试样品，准确称定后，置凯氏定氮仪消化瓶中，加消化剂硫酸钾6 g、硫酸铜0.4 g，再沿瓶壁缓缓加硫酸20 mL进行消化，当消化温度达到420 ℃之后，继续消化1 h，当消化管内容物的颜色逐渐转化成透明的淡绿色时，取出冷却后加入50 mL水，于自动凯氏定氮仪上实现自动加液、蒸馏、滴定、记录滴定数据。同法检测空白对照样品。

2.3.3方法学考察

2.3.3.1重复性试验 取西红花柱头，按照2.3.1项下方法平行制备6份供试品溶液，用自动凯氏定氮仪进行测定，计算蛋白质含量及RSD，结果表明，蛋白质质量分数为162.67～162.93 g·kg-1，RSD为0.05%，方法的重复性良好。

2.3.3.2加样回收率试验 取质控样品按照2.3.2项下方法平行制备2份供试品溶液，测定蛋白质含量并与质控样品的标准值比较，测定值均值为239.02 g·kg-1，在质控样规定标准范围内(233.90～250.00 g·kg-1)，结果表明，该方法的准确度符合要求。

2.3.4样品蛋白质含量测定 分别称取西红花花瓣(挑选)、西红花花瓣(未挑选)及西红花柱头约0.5 g，按照2.3.2项下制备样品，进行样品测定(n=3)。结果表明，西红花花瓣(挑选)、西红花花瓣(未挑选)及西红花柱头蛋白质质量分数分别为117.15、137.78、162.90 g·kg-1。

3 讨论

挑选、未挑选西红花花瓣和西红花柱头的氨基酸、微量元素和蛋白质含量检测结果显示，样品中均含有6种人体所需的必需氨基酸(Thr、Val、Ile、Leu、Phe、Lys)，必需氨基酸的含量分别占总氨基酸含量的38.0%、35.5%、39.5%。西红花花瓣中还含有大量的Glu。文献报道，Glu是一种重要的兴奋性神经递质，主要用于治疗肝性昏迷，还可改善儿童智力发育，可作为筛查智商正常的高功能孤独症儿童的诊断指标[17]。西红花花瓣含有人体所必需的6种微量元素(Cr、Fe、Co、Cu、Mo、Zn)，未检测到对人体有潜在危害的重金属元素Sn和Hg，并且As、Cu、Cd、Pb的含量也都符合《中华人民共和国药典》2020年版重金属限量的规定。同时西红花花瓣还富含大量的K，含量高于西红花柱头，约占总微量元素的84.5%。K为人体必需的矿物质元素之一，主要分布在人体细胞内，维持细胞内渗透压和细胞内外的酸碱平衡。人体缺钾后，容易产生心肌损害，引起细胞变性和坏死，此外还会对肾、肠和骨骼造成一定的损伤[18]。除此之外，西红花花瓣中蛋白质含量虽低于西红花柱头，但种类也较丰富。

检测数据证实，西红花花瓣含有丰富的营养物质，可以在保健食品方面对其进行开发和研究，并通过动物实验和临床研究对其进行深入研究，提高其利用价值。虽然西红花花瓣有些营养成分的含量低于柱头，但是在1朵西红花中，柱头仅占很小的一部分。我国上海崇明的西红花种植已达上千亩，农户在采摘柱头后，其主要副产物花瓣都被丢弃，有些柱头还残剩在花瓣上，造成了严重的资源浪费。若将这些西红花花瓣合理利用，将会对西红花柱头的短缺起到一定的缓解作用，同时也会降低种植成本、增加农户收益、促进当地的经济发展、减少环境污染。