我国咖啡炭疽病菌致病力分化

2021-08-05贺春萍吴伟怀梁艳琼郑金龙习金根谭施北易克贤

西南农业学报 2021年5期

陆英，贺春萍，吴伟怀，梁艳琼，郑金龙，黄兴，习金根，谭施北，易克贤

(中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业农村部热带农林有害生物入侵检测与控制重点开放实验室/海南省热带农业有害生物检测监控重点实验室海南海口 571101)

【研究意义】咖啡，学名Coffea，又名咖啡树、阿拉伯咖啡等，为茜草科咖啡属多年生经济作物。咖啡是世界上除石油以外的最大交易品，产量、产值及消费量均位居世界三大饮料作物(咖啡，茶叶，可可)之首，每年零售额达700亿美元[1-4]，是全球经济的重要组成部分，全世界有70多个国家种植咖啡，主要分布于拉丁美洲、中西亚、中东南亚等[5]。我国咖啡种植区主要分布在云南和海南等热带地区。云南省以小粒咖啡为主，主要种植于南部和西南部的思茅、保山、德宏、西双版纳和文山等地区，海南以中粒咖啡为主，主要种植于万宁、澄迈、文昌、海口等地[6]。由炭疽菌(Colletotrichumspp.)引起的咖啡炭疽病是一种在咖啡树上极易爆发流行的重要病害，在我国咖啡产区连年发生，病原菌可侵染嫩叶、叶柄、枝条和咖啡浆果等部位，引起叶片脱落、枝条干枯和果实腐烂，严重影响咖啡的产量和品质[7-9]，已成为我国咖啡高产、稳产的主要生物限制因子之一。不同炭疽菌种的致病性可能存在一定差异，因此研究病原菌组成及其致病力的分化状况可为咖啡炭疽病的防治提供理论基础。【前人研究进展】目前，国外学者对咖啡炭疽病的研究集中在咖啡浆果炭疽病(Colletotrichumkahawae)的病原学、抗病育种、寄主与病原互作方面[10-12]。但咖啡浆果炭疽菌在我国未见报道，并被列为我国入境植物检疫性有害生物。国内学者的研究多集中在海南种植区域咖啡炭疽病原菌鉴定、发病规律、生物学特性、药剂筛选等方面[13-14]。【本研究切入点】前人对咖啡炭疽病病原菌鉴定的取样点仅限于海南省内的咖啡种植地，而我国云南省咖啡种植面积和产量占全国的90 %以上[15]，且不同省份咖啡的主栽品种和栽培条件都存在差异，咖啡炭疽病菌的种类和致病力是否存在差异不得而知，也未见相关报道。【拟解决的关键问题】对我国咖啡主要种植区疑似炭疽病的咖啡叶片、枝条和浆果进行组织分离，利用形态学结合ApMat基因序列比对和系统发育进化分析方法对病原菌进行鉴定，旨在了解我国咖啡炭疽病病原菌种类及组成情况，采用人工接种方法对分离菌株进行致病力测定，明确不同菌种的致病力及优势种群，为咖啡抗病育种筛选和病害防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所热带特色经济作物病害研究室于2018-2019年在海南和云南省9个咖啡种植基地采集具有咖啡炭疽病典型症状的叶片和枝条，经组织分离及纯化获得的74株菌株。用于致病力测定的咖啡品种为Catimor 7963，来源于农业农村部云南瑞丽咖啡种质资源圃。

1.2 试验方法

1.2.1 形态学观察经常规组织分离法及单孢分离纯化获得的菌株，在PDA培养基上培养5～7 d，定期观察并记录各菌株的形态特征，包括菌落大小、颜色、边缘形状、菌丝疏密以及菌丝生长和产孢速度。显微观察附着胞的大小、颜色和形态。根据菌落和分生孢子形态特征对菌株进行初步的形态学鉴定[16]。

1.2.2 致病性测定选取生长良好、大小相近的Catimor 7963嫩叶作为接种材料。接种前，用无菌水冲洗，1 % 次氯酸钠溶液浸泡10 min，再用无菌水冲洗3～4 遍，阴凉处晾干叶片，整齐排放于接种盘里，然后将PDA上已培养5 d的待测菌株取直径为6 mm的菌饼接种于叶片上，每个处理6次重复，并以无菌PDA培养基接种作为对照。接种后用保鲜膜进行密封保湿，并将接种盘置于28 ℃恒温培养箱中恒温培养。接种5 d后检查病情，统计病斑扩展情况。

1.2.3 咖啡炭疽病病情分级标准及致病力分化测定咖啡炭疽病病情分级参考黄根深和赖剑雄[17]的标准。0级：接种叶片无病斑；1级：接种叶片病斑面积之和<叶片总面积的1/8；2级：叶片总面积的1/8≤叶片病斑面积<叶片总面积1/4；3级：叶片总面积的1/4≤叶片病斑面积<叶片总面积1/2； 4级：叶片病斑面积≥叶片总面积1/2。菌株致病性类型划分标准参考李越等[18]标准：强致病类型：病情指数40～100.00；中致病类型：病情指数20～40；弱致病类型：病情指数0.10～20；无致病类型：病情指数为0。

病情指数=∑(各级发病数×发病级数)/(调查数×4)×100

1.2.4 咖啡炭疽病菌ApMat基因序列分析参照Silva等[19]的方法，采用真菌DNA提取试剂盒(Omega Fungal DNA Kit 50)提取病原菌总DNA并进行ApMat基因序列的PCR扩增和序列分析，扩增所用引物为如下。AMF：5′-TCATTCTACGTATGTGCCCG-3′;AMR：5′-CCAGAAATACACCGAACTTGC-3′。

PCR反应体系：PCR Mixture 25 μl，10 μmol/L的左引物和右引物各2 μl，模板DNA 2 μl，最后加dd H2O补足至50 μl。

PCR反应程序：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环次数35次，最后72 ℃延伸10 min。

扩增结束后，取8 μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测(1 %，0.5×TAE电泳缓冲液)，将目标条带单一且清晰的PCR产物采用琼脂凝胶回收试剂盒进行回收，并将PCR回收产物送至上海尚铂生物技术有限公司进行测序。将测序所获得的每个菌株的ApMat基因序列在GenBank数据库中进行BLAST比对分析，下载与供试菌株基因序列相近菌种所对应的基因序列作为参考菌株，运用Bioedit 和MEGA 4.0 构建系统发育进化树。

1.3 统计分析

试验所获数据均采用SAS 9.0 软件进行统计分析，多重比较采用 Duncan’s 新复极差检验法。

2 结果与分析

2.1 咖啡炭疽病菌的种类描述

55株炭疽菌在PDA上培养5～7 d后，观察菌株的培养特征，经形态鉴定，获得24株Colletotrichumsiamense，其中8株(BSC2-1、BSC 2-2、BSC 4-1、BSC 7-1、BSC 7-2、BSC 9-1、BSC 9-3、BSC 10-2)来自海南白沙咖啡种植基地，3株(BD 15、BD 18、BD 23)来自云南芒市崩洞咖啡种植基地，2株(HG6、HG 9)来自云南后谷咖啡种植基地， 4株(BEC70A、BEC75A、BEC76B、BEC77D)来自云南南岛河， 2株(BEC59A、BEC741B)来自云南热带作物学院示范基地，2株(BEC91B、BEC176B)来自农业农村部云南瑞丽咖啡种质资源圃，1株(RBEC193B)来自云南兴华农场，2株(F3-1、CF2)来自海南福山咖啡种植基地。获得22株C.nupharicola，其中3株(BSC1-2、BSC 14-1、BSC 15-1)来自海南白沙咖啡种植基地，3株(HG7、HG 8、HG 10)来自云南后谷咖啡种植基地，9株(RL24、RL 25、RL 28、RL 29、RL 30、RL 31、RL 33、BEC80A 、BEC156A)来自农业农村部云南瑞丽咖啡种质资源圃，2株(BEC76A、BEC 77A)来自云南南岛河，2株(BEC10A、BEC 14B)来自云南热带作物学院示范基地，3株(BEC106B、BEC 126B、BEC 127B)来自云南文山麻栗坡。获得9株C.theobromicola，6株(BSC1-3、BSC 6-1、BSC 8-1、BSC 8-3、BSC 13-1、BSC 14-2)来自海南白沙咖啡种植基地，1株来自海南福山咖啡种植基地(IG3)、1株(RL32)来自农业农村部云南瑞丽咖啡种质资源圃，1株(BEC108A)来自云南文山麻栗坡。C.siamense、C.nupharicola、C.theobromicola占比分别为：43.64 %、40 %和16.34 %。详细结果如表1所示。

表1 供试咖啡炭疽病菌菌株信息

2.2 咖啡炭疽病病原菌的分子鉴定

对获得的菌株进行ApMat基因PCR扩增，得到长度约为979 bp的基因片段，其电泳后条带位置如图1所示(仅展示了部分炭疽菌菌株的电泳结果)，引物的特异性较好，所得条带均清晰明亮且单一无杂带，将PCR 产物进行胶回收后送至上海尚铂生物技术有限公司进行测序。

通过初步分析明确了74个供试菌株中的55株供试菌株属于胶孢复合种群，其余19株供试菌株属于胶孢复合种群之外的菌种，因此，利用对胶孢炭疽复合种群具有高效鉴定作用的ApMat基因对55个胶孢炭疽复合种群内的供试菌株进行分析，通过软件MEGA 6.0采用NJ法构建系统进化树(图2)。55个供试菌株被分成3种，其中24个菌株在分支Colletotrichumsiamense上，支持率为71 %；9个菌株被分在C.theobromicola分支上，支持率为99 %；还有22个菌株位于C.nupharicola分支上，支持率为99 %。

2.3 咖啡炭疽病菌的致病力分化研究

根据致病力将55株菌株分为强致病性菌、中致病性菌和弱致病性菌。其中，强致病性菌38株，病情指数在42.01～75.56；中致病性菌6株，病情指数在28.56～38.68；弱致病性菌11株，病情指数在10.25～19.88。其中Colletotrichumtheobromicola的致病力最强，分离所获得的9株菌株均具有强致病力；其次是C.siamense，在获得的24株菌株中，有18株具有强致病力，达到75 %；在22株C.nupharicola菌株中，强致病力菌株有11株，其余菌株中有4株致病力中等，7株致病力较弱；55株炭疽菌株的致病性分化与地理来源有一定的关系，来自于海南白沙咖啡种植基地和云南农业种质资源苗圃的大部分炭疽菌株致病力属中致病性或强致病性。

3 讨论

本文采用形态学结合ApMat基因序列比对分析法，将55个咖啡炭疽菌株鉴定分为3个炭疽菌种，分别为Colletotrichumsiamense(24株，43.64 %)、C.nupharicola(22株，40.00 %)、C.theobromicola(9株，16.36 %)。李杨[20]对海南省油茶炭疽病菌进行鉴定，发现C.camelliae、C.siamense、C.fructicola3个种；曹学仁等[14]对橡胶树上的炭疽致病菌种进行研究，发现C.fructicola、C.siamense、C.cairnsense3个种，说明能侵染作物的炭疽菌种类型较丰富。本次试验获得的3个炭疽菌种中C.siamense的占比最高，为43.64 %，此前，C.siamense寄主范围广泛，全球分布，能引起多种植物炭疽病[21-24]，该菌是Than 等[25]首次从泰国辣椒上分离出的，但当时被鉴定为C.gloeosporioides， Weir等[21]对这一结果进行了修正。

形态学特征在炭疽菌属的分类鉴定中发挥了重要作用。吴文平等[26]认为炭疽菌的形态特征在种间差异较大，而在种内较稳定，可作为炭疽菌属分类鉴定的一项重要依据。Liu等[27]研究表明，除C.gloeosporioides，C.simense，C.fruticola3个近缘种外，依据分生孢子的形态和大小可以明显区分C.truncatum，C.scovillei和C.brevisporum。但本试验获得的3个炭疽菌种的分生孢子和附着孢在形态、大小和颜色等形态特征上较为相似，并且同一种内的形态也并不一致，所以无法根据特征准确鉴定菌种。因此在炭疽菌属的分类鉴定中单凭形态学特征无法将菌株进行准确的鉴定，需要借助分子生物学等其它方法进行辅助鉴定。

表2 55株炭疽病菌菌株致病性测定结果

MAT(mating type locus)基因是真菌基因组中独特的片段，能够控制细胞配型识别和编辑有性循环，包含丰富的遗传信息，可用于建立其亲缘关系和物种的界限[28-29]。最近研究表明，ApMat标记能够有效对C.gloeosporioides复合种和Csiamense复合种进行种类鉴定[19,22,30-31]，Sharma等在芒果胶孢炭疽菌株鉴定研究中，相对多基因(ITS、ACT、CAL、Tub2、CHS-1和GAPDH)序列分析法，ApMat单基因序列分析法能更精确的区分大多数种，并且将遲罗炭疽菌确定为复合种[31]；进一步依据ApMat序列对来自印度的 73个暹罗炭疽复合种菌株构建系统发育树，鉴定出6个已知种和1个新种。本次试验中利用ApMat基因对复合种群进行分析，共鉴定出了3个炭疽菌种，分别为C.siamense、C.nupharicola、C.theobromicola。

炭疽菌具有很强的侵染性，可危害多种植物，但在不同寄主植物、地域、气候等环境条件下，优势种群也会发生改变，并且不同菌种之间的致病性及致病力均有差异。在致病力测定试验中，发现不同菌种之间致病力存在明显差异。其中C.theobromicola的致病力最强，来自海南白沙咖啡种植基地和云南农业种质资源苗圃的大部分菌株致病力属中等以上。