十伤灵促进大鼠难愈性溃疡创面愈合的机制研究

朱小雨，贡翊斐，吴 迎，王小平,董丽琴，蔡惠群，王 群

(上海中医药大学附属市中医医院，上海 200071)

伤口的愈合包括止血、炎症、增殖和重塑4个阶段，任何一个阶段出现异常，都可能导致伤口愈合时间延长[1]。当创面超过8周仍未愈合，则发展为慢性伤口[2]。临床上由于血管病变(如静脉曲张、血栓后综合征、外周动脉闭塞性疾病等)、糖尿病、酒精、代谢性疾病(如钙代谢紊乱、卟啉病)、外部因素如压力等都可导致慢性伤口经久不愈，成为难愈性溃疡[2]。中医外治法在难愈性溃疡的治疗中取得了一定的成果[3]。本课题组前期实验研究证实十伤灵能通过上调碱性成纤维生长因子(bFGF)和碱性成纤维生长因子受体(bFGFR)的表达，促进成纤维细胞的生长而加快创面愈合[4]。本研究秉承顾氏外科治疗难愈性溃疡活血化瘀、顾护阴津的思想和缠敷的特色疗法[5-7]，运用十伤灵干预大鼠难愈性溃疡，进一步探讨其促进创面愈合的机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 36只SPF级健康雄性Wistar大鼠，每只体重200～220 g，由上海实验动物研究所提供，许可证号：SCXK(沪)2012-0002。

1.2药物与试剂 十伤灵中药膏(自制)、氢化可的松琥珀酸钠(上海市中医医院实验中心提供)、重组牛碱性成纤维细胞生长因子(贝复济，上海市中医医院提供，批号：s10980077)、水合氯醛、乙醇、生理盐水(上海市中医医院实验中心提供)、免疫组化试剂盒(汉博士德生物工程有限公司，编号：SV0002)。

1.3主要仪器 自备造模装置(直径为3 cm的有柄圆形铁盖在造模区描记造模面积)，切片机，电子生物显微镜(德国徕卡公司产品)，医学图像分析软件(上海申腾信息技术有限公司)，电子天平。

1.4实验方法 将36只SPF级雄性Wistar大鼠按照随机数据表法分为生理盐水组、贝复济组、十伤灵组，每组12只。均置于实验室20～25 ℃的环境中，常规喂养1周后开始造模。造模开始前，所有大鼠需维持禁食状态12 h。在无菌条件下，腹腔注射10%水合氯醛(0.4 mg/100 g)麻醉大鼠后，选取背部中下侧皮肤，用剃毛刀剃毛备皮。用直径为3 cm的圆形铁盖在造模区描记造模面积，裸露皮肤碘伏常规消毒，在无菌条件下用手术剪沿标记线剪取全层皮肤至筋膜层，止血，形成一般创面模型；于造模后即刻肌注氢化可的松(8 mg/100 g)制成难愈性创面模型，2层无菌纱布包裹覆盖，医用胶布固定。十伤灵组和贝复济组分别用生理盐水和十伤灵、贝复济行常规换药处理，2次/d，连续14 d；生理盐水组行常规生理盐水冲洗，2次/d，连续14 d。

1.5观察指标

1.5.1创面愈合率 分别于造模7 d、14 d后计算各组创面愈合率。以透明敷料映衬溃疡表面勾勒出溃疡范围，取下敷料平展于数码相机下，将数码相机固定于同一位置拍照，保存图片并输入电脑，用Image J软件计算创面面积。创面愈合率=(原始创面面积-残余创面面积)/原始创面面积×100%。

1.5.2创面组织病理学形态 造模7 d、14 d后，每组分别处死6只大鼠，取创面组织并立即放入4%多聚甲醛固定24 h后脱水、二甲苯透明，放入融化的石蜡中浸泡30 min、包埋，待冷却后切为4 μm厚的切片，经二甲苯脱蜡、乙醇梯度水化后进行苏木素和伊红染色，脱水透明后放于显微镜下采集图片。

1.5.3创面组织中转化生长因子β1(TGF-β1)、血小板衍生因子(PDGF)表达情况 造模7 d、14 d后，采用免疫组化方法检测石蜡切片中TGF-β1、PDGF表达情况。石蜡切片经过抗原修复、内源性过氧化物酶灭活、封闭、一抗孵育、二抗孵育、苏木素染色、二甲苯透明、封片后，在电子显微镜下随机选取3个视野保存为图片，棕褐色为阳性，图片导入Image J软件中，计算平均光密度值(累计光密度/阳性面积)。

2 结 果

2.1各组创面愈合率比较 各组造模14 d后的创面愈合率均明显高于造模7 d后(P均<0.05)。造模7 d后，十伤灵组创面愈合率明显高于贝复济组和生理盐水组(P均<0.05)，贝复济组与生理盐水组比较差异无统计学意义(P>0.05)。造模14 d后，十伤灵组创面愈合率明显高于贝复济组和生理盐水组(P均<0.05)，贝复济组高于生理盐水组(P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠创面愈合率比较

2.2各组创面组织HE染色表现 造模7 d后，十伤灵组可见成纤维细胞和毛细血管中度生长，贝复济组可见成纤维细胞中度生长，生理盐水组见少量散在的成纤维细胞，见图1。造模14 d后，十伤灵组新生的毛细血管增多，成纤维细胞视野内较多见且排列整齐，贝复济组出现新生的毛细血管，生理盐水组出现新生的毛细血管和成纤维细胞，见图2。

图1 造模7 d后各组大鼠创面组织HE染色形态(×10)

图2 造模14 d后各组大鼠创面组织HE染色形态(×10)

2.3各组创面组织中TGF-β1和PDGF表达情况比较 造模7 d后，十伤灵组和贝复济组创面组织中TGF-β1表达量均明显高于生理盐水组(P均<0.05)，十伤灵组和贝复济组比较差异无统计学意义(P>0.05)；十伤灵组创面组织中PDGF表达量均明显高于贝复济组和生理盐水组(P均<0.05)，贝复济组和生理盐水组比较差异无统计学意义(P>0.05)。造模14 d后，十伤灵组大鼠创面中TGF-β1和PDGF表达量均明显低于生理盐水组及贝复济组(P均<0.05)，贝复济组均明显高于生理盐水组(P均<0.05)。见表2。

表2 3组大鼠创面组织中TGF-β1和PDGF表达情况比较

3 讨 论

难愈性溃疡有病情反复、致病因素复杂、预后差等特点，其创面难以愈合的机制多认为与局部组织缺氧、细菌在伤口集群、反复的缺血再灌注损伤、伤口愈合有关细胞的活动改变和应激反应时全身性因素的改变有关[8]。非手术治疗难愈性创面主要有生长因子和富血小板血浆类药物、干细胞移植疗法和中药外用制剂[9]。顾氏外科第五代传人王小平教授认为难愈性溃疡关键的致病因素为“瘀”和“虚”导致创面经久不愈和反复发作[7]。局部气血瘀滞导致肌肤失荣、经脉失养，腐肉不去、新肉难生，且局部瘀血日久则化湿生热，疾病进一步传变加重，导致病情更为复杂多变；病情反复发作耗伤正气，正虚则易感邪气，气血虚弱运行无力则致气滞血瘀，外感加内伤导致创面愈合时间延长。

十伤灵源自民间古方，方中有麝香、冰片、珠粉等药物，通过制成油膏外敷于患处，有止痛止血、清热解毒、去腐生肌的作用[10]。其中麝香、冰片入心经，为辛香的开窍药，能够开窍醒神、活血通经、消肿止痛，疏通局部气血瘀滞，化浊去腐，改善局部血供，促进新肉生长[11]。现代药理研究发现冰片中萜类物质和麝香中的活性成分麝香酮外用能促使角质层细胞结构发生改变、局部血管扩张，从而促进药物的透皮吸收，提高疗效[12]。珍珠粉性味甘寒，除可以息风止痉外，还可以解毒生肌、润肤祛斑。体外研究发现，纳米珍珠粉在创面中能够快速释放多肽活性物质，能够促进创面中角质形成细胞增殖和迁移，促进血管的新生以及创面中Ⅰ型胶原蛋白的沉积，从而促进创面愈合[13]。

创面愈合中止血、增殖和成熟三个时期依次或交叠进行，创面初期血小板活化后释放TGF-β1和PDGF募集炎症细胞和成纤维细胞聚集于伤口处，并且促进成纤维细胞增殖和细胞外基质的生成，从而成为创面愈合中重要的细胞因子[14-15]。相较于急性创面，慢性创面中TGF-β1和PDGF表达水平较低，难以促进肉芽组织的生长，导致伤口难以愈合[16]。当创面过度修复时，则会出现相反的结果形成瘢痕[17]，目前瘢痕形成公认的信号通路包括TGF-β1和PDGF[18]。故本实验主要从观察TGF-β1和PDGF表达情况来探究十伤灵促进大鼠难愈性创面愈合的机制。

本实验结果显示，造模7 d后，十伤灵组镜下见肉芽组织较多，十伤灵组和贝复济组创面组织中TGF-β1和PDGF表达量均明显增加。造模14 d后，创面愈合进入后期成熟阶段，十伤灵促进肉芽组织的生长作用甚微，且十伤灵组创面组织中TGF-β1和PDGF表达量均低于贝复济组，提示十伤灵可防止成纤维细胞过度生长形成瘢痕。以上结果提示，十伤灵可能是通过调节TGF-β1和PDGF在创面愈合过程中不同时期的表达水平来促进大鼠难愈性创面的愈合，且有防止瘢痕形成的作用。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。