膜联蛋白A7过表达对人胃癌MGC-803细胞增殖和凋亡的影响

王小杰，柏友兰，刘明伟，王新杰，李宏伟，李 欣*

（1.承德医学院基础医学院，河北承德 067000；2.承德市中心医院肿瘤科；3.承德市围场满族蒙古族自治县医院消毒供应中心）

胃癌是全球最为常见的恶性肿瘤之一，在我国的发病率及死亡率较高[1]，由于其早期症状不明显，加之当前缺乏简易灵敏的筛查标志物，多数患者发现时便已经是晚期，给人们的健康和生活带来严重威胁，因此，寻找早期诊疗标志物已经非常必要。膜联蛋白A7（annexin A7,ANXA7）是第一个被分离出来的Ca2+依赖的磷脂结合蛋白超家族的一员[2]，在细胞水平上发挥着胞外分泌、膜运输以及钙离子动态平衡等多种功能[3]。除此之外，大量研究表明，ANXA7在多种恶性肿瘤组织中都有异常的表达。在胃癌组织中，ANXA7表达异常增高[4]，这提示，ANXA7与胃癌的发生发展存在某种关联，本研究通过在胃癌MGC-803细胞过表达ANXA7，观察MGC-803细胞增殖和凋亡的改变，从而为胃癌诊疗标志物的寻找提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人胃癌MGC-803细胞（赛百慷上海生物公司）；细胞培养基1640及胎牛血清（Gibco公司，美国）；CO2培养箱（贺利公司，德国）；pcDNA3.1-ANXA7重组质粒及空质粒购自Sino Biological公司，转染试剂lipofectamine2000（lipo2000）（Invitroden公司产品，美国）；ANXA7、PCNA、CyclinD1、Casepase-3、Cleaved casepase-3及β-actin鼠源单克隆抗体均（Epitomics公司，美国），羊抗鼠二抗（KPL公司，美国），CCK-8（APExBIO公司，美国），细胞凋亡试剂盒（BD公司，美国）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及转染 人胃癌MGC-803细胞于含10%胎牛血清的1640培养基中，置于5%二氧化碳的37℃细胞培养箱中培养。将细胞分为ANXA7过表达组（pcDNA3.1-ANXA7）、阴性对照组（pcDNA3.1-NC）。其中ANXA7过表达组转染pcDNA3.1-ANXA7重组质粒，阴性对照组转染空质粒。取处于对数生长期的MGC-803细胞，转染前24h接种于6孔板中，每孔细胞2.5×105个，每孔加入2ml完全培养基，细胞达到60%～70%汇合度时，进行质粒转染，每孔质粒用量为2.5μg，lipo2000为5μg，无血清培养基稀释混合后室温静置15min，将混合物加入6孔板中。柔和混匀，置于培养箱中培养，于48h收集细胞进行后续相关检测。

1.2.2 Western blot检测ANXA7过表达情况 收集各组细胞，每孔加入100μl细胞裂解液，提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒检测总蛋白浓度，100℃处理10min使蛋白变性，每个泳道加入30μg蛋白，80V稳压电泳，2.5mA/cm2稳流转膜，封闭过夜，ANXA7单抗（1:1000）室温孵育2h，TBST洗膜3次，二抗（1:5000）室温孵育1h，TBST洗膜3次，ECL超敏发光，使用化学发光仪显影并保存条带。Quantity One 4.6.2软件计算条带灰度值，计算ANXA7/β-actin数值，即ANXA7的相对表达量。

1.2.3 CCK-8实验 质粒转染12h后将细胞消化成细胞悬液，按5×103个/孔的密度接种于96孔板，每组5个副孔，每孔细胞悬液100μl，质粒转染48h时每孔加入10μl CCK-8溶液，将培养板在培养箱中放置2h，用酶标仪测定450nm处的吸光度值。

1.2.4 流式细胞术检测各组细胞凋亡率 质粒转染48h后，用不含EDTA的0.25%的胰蛋白酶消化细胞，制成单细胞悬液，每组计数5×105个，加入Annexin Ⅴ-FITC和PI各5μl进行双染，室温避光5min后上流式细胞仪检测。

1.2.5 Western blot检测增殖、凋亡及通路相关蛋白表达情况 收集各组细胞，每孔加入100μl细胞裂解液，提取细胞总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒检测总蛋白浓度，100℃处理10min使蛋白变性，每个泳道加入30μg蛋白，80V稳压电泳，2.5mA/cm2稳流转膜，封闭过夜，PCNA、CyclinD1、Casepase-3、Cleaved casepase-3单抗（1:1000）室温孵育2h，TBST洗膜3次，二抗（1:5000）室温孵育1h，TBST洗膜3次，ECL超敏发光，于化学发光仪显影并保存条带。Quantity One 4.6.2软件计算条带灰度值，计算目的蛋白/β-actin数值，即目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各实验组ANXA7的表达情况

与阴性对照组相比，pcDNA3.1-ANXA7组ANXA7蛋白的表达显著升高（P＜0.05），差异有统计学意义（图1）。

图1 ANXA7表达情况

2.2 ANXA7过表达促进MGC-803细胞的增殖

与阴性对照组相比，pcDNA3.1-ANXA7组细胞的增殖活力明显增强，差异有统计学意义（P＜0.05）。Western blot进一步检测各组细胞中增殖相关蛋白PCNA、CyclinD1的表达，发现pcDNA3.1-ANXA7组中PCNA和CyclinD1均升高（P＜0.05）,如图2：

图2 ANXA7过表达促进胃癌MGC-803细胞的增殖

2.3 ANXA7过表达抑制MGC-803细胞的凋亡

与阴性对照组相比，pcDNA3.1-ANXA7组细胞凋亡率显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。采用Western blot进一步检测各组细胞凋亡相关蛋白Casepase-3、Cleaved casepase-3的表达，发现ANXA7过表达组中，Cleaved caspase-3的表达降低（P＜0.05），差异有统计学意义；Casepase-3的表达变化不大，差异无统计学意义（P＞0.05）（图3）。

图3 ANXA7过表达抑制MGC-803细胞的凋亡

3 讨论

胃癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，早期难发现，易转移。其发病率及死亡率在全球范围内一直位居前列，其手术及放化疗治疗效果差，预后不良[5]，寻找有效的诊疗标志物迫在眉睫。

ANXA7是一类具有广泛生物学功能的磷脂结合蛋白，与细胞的生长、分化、增殖及凋亡等环节密切相关[6,7]。很多研究发现ANXA7在多种肿瘤组织中存在着异常的表达[8,9]，Yuan等[10]发现ANXA7在胃癌组织中的表达较癌旁正常组织明显增高。在本课题组之前的研究中，我们通过免疫组化检测了ANXA7在细胞中的定位，Western blot和RT-PCR分别从蛋白和mRNA水平检测了胃癌组织及癌旁组织中ANXA7的表达，发现ANXA7 主要定位于细胞质中，在正常胃组织中胃腺上皮细胞胞质呈浅黄色，在胃癌细胞中呈深黄色，ANXA7在胃癌组织中的表达明显增高，差异显著[11]。叶卫华等通过检测ANXA7在胃癌患者癌组织及外周血液中的变化情况发现ANXA7在胃癌组织中的表达升高，其表达水平与胃癌的恶性程度与进展密切相关，且胃癌患者外周血液中ANXA7的水平能较好反映其在癌组织中的表达水平[12]。以上研究表明，ANXA7与胃癌的发生发展可能存在某种关联。本研究通过在人胃癌MGC-803细胞中过表达ANXA7，检测其对胃癌细胞增殖和凋亡的影响，进一步明确ANXA7在胃癌的发生发展中的作用。

CyclinD1是一个由人类CCND1基因所编码的蛋白质，是细胞周期G1期和S期的转换开关，研究表明CyclinD1可正向调控细胞周期，其增高可促进肿瘤细胞恶性增殖[13]。增殖核抗原PCNA是仅在增殖细胞中合成与表达的一种酸性非组胺核蛋白，该蛋白在DNA复制合成修复过程中必不可少。PCNA可反映肿瘤细胞的增殖活性，是评估细胞增殖状态的黄金指标[14]。本研究发现，在胃癌MGC-803细胞中过表达ANXA7之后，细胞增殖活力增强，CyclinD1和PCNA蛋白表达升高，表明ANXA7促进了胃癌MGC-803细胞的增殖。

Caspase-3为天冬酞胺特异酶切的半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡早期阶段，其常常作为关键酶被激活，Caspase-3在细胞凋亡过程中承前启后，是目前已知的凋亡最终执行因子，被称为死亡蛋白酶[15]。Caspase-3在细胞中通常以无活性的Caspase-3前体存在，只有当细胞接收到凋亡信号指令或受到外界刺激时，Caspase-3才能转变为有活性的Caspase-3，又称为裂解的Caspase-3,即Cleaved Caspase-3，其具有成熟酶的性质，可通过酶切割特异性底物，DNA依赖性蛋白激酶等参与细胞凋亡的发生[16]。因此，人们常把Caspase-3的激活作为判断细胞凋亡严重性的黄金指标之一。若Caspase-3蛋白的激活受到抑制，则凋亡明显减少。本研究显示，在MGC-803细胞中将ANXA7过表达后，ANXA7过表达组Cleaved caspase-3蛋白表达低于阴性对照组，提示ANXA7的过表达可能抑制了Caspase-3前体的激活而导致Cleaved caspase-3表达减少，从而减轻了胃癌细胞凋亡的产生，流式细胞术的检测结果正好与之吻合，过表达组细胞凋亡率显著降低。

综上，ANXA7在胃癌MGC-803细胞中过表达可促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，有望为临床胃癌诊疗备选标记物的筛选提供一定的参考。