甘薯黄烷酮3-羟化酶基因IbF3H的克隆和表达特性分析

宋天晓 苏文瑾 刘意 饶莉萍 Soviguidi Deka Reine Judesse 杨新笋 朱国鹏

摘  要：黃烷酮3-羟化酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）是黄酮类化合物合成途径中的一个关键酶。本研究基于前期转录组数据，以‘福菜薯7-6叶片为材料成功克隆CDS序列长度为1107 bp的基因IbF3H，利用生物信息学分析甘薯F3H基因的序列特征、氨基酸序列对比、蛋白系统进化树、蛋白的二、三级结构、预测其跨膜结构和亚细胞定位，并利用qRT-PCR分析盐旱胁迫处理下基因的表达特性。结果表明，该基因含有3个外显子和2个内含子，编码368个氨基酸，蛋白分子量为41.12 kDa，等电点为5.83。存在多种类型的启动子顺式作用元件，如光响应元件G-Box、ACE，干旱胁迫相关的MBS元件，与脱落酸激素响应相关的ABRE元件等。与其他植物的氨基酸序列相似性达到了80%以上，可见IbF3H的编码区高度保守，且黄烷酮3-羟化酶在进化上具有较高的保守性。IbF3H蛋白含有非血红素双加氧酶结构域（DIOX-N superfamily）和典型的F3H蛋白功能结构域（2OG-FeⅡ-Oxy加氧酶结构域），属于双加氧酶超家族。IbF3H蛋白可能在细胞质中表达并且不具备跨膜结构。qRT-PCR研究结果表明，IbF3H基因并非组织特异性表达的基因，叶和茎表达量高于茎尖和根。模拟盐胁迫处理后，IbF3H基因表达量呈现先下降后上升的趋势;模拟干旱胁迫处理后，IbF3H基因表达量始终高于对照组，以响应逆境胁迫。本研究可为下一步探索IbF3H基因在调控甘薯类黄酮生物合成途径和功能作用奠定基础。

关键词：甘薯;黄烷酮3-羟化酶基因;qRT-PCR;胁迫表达

中图分类号：S531      文献标识码：A

Cloning and Expression Analysis of Sweetpotato Flavanone 3-Hy- droxylase Gene IbF3H

SONG Tianxiao1，2， SU Wenjin1， LIU Yi1，3， RAO Liping1，3， Soviguidi Deka Reine Judesse1，3， YANG Xinsun1*， ZHU Guopeng2

1. Food Crops Institute， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan， Hubei 430064， China; 2. College of Horticulture， Hainan University / Key Laboratory for Quality Regulation of Tropical Horticultural Plants of Hainan Province， Haikou， Hainan 570228， China; 3. College of Agriculture， Yangtze University， Jingzhou， Hubei 434025， China

Abstract： Flavanone 3-hydroxylase （F3H） is a key enzyme in the synthesis of flavonoids. In this study， based on previous transcriptome data， a 1107 bp IbF3H CDS sequence was successfully cloned from ‘Fucaishu 7-6 leaves， using bioinformatics to analyze sweetpotato F3H gene sequence characteristics， amino acid sequence comparison， protein phylogenetic tree， secondary and tertiary structure of protein， predicting transmembrane structure， subcellular localization， and using qRT-PCR methods to analysis gene expression characteristics under simulated salt and drought stress. The results showed that the gene contained 3 exons and 2 introns， encoding 368 amino acids， the protein molecular weight was 41.12 kDa， and the isoelectric point was 5.83. There were types of promoter cis-acting elements， such as light-responsive elements G-Box and ACE， MBS elements related to drought stress， ABRE elements related to abscisic acid hormone response， etc. The amino acid sequence similarity with other plants was more than 80%. It could be seen that the coding region of IbF3H was highly conserved， and the flavanone 3-hydroxylase was highly conservative in evolution. The IbF3H protein contained a non-heme dioxygenase domain （DIOX-N superfamily） and a typical F3H protein functional domain （2OG-FeⅡ-Oxy oxygenase domain） and belonged to the dioxygenase superfamily. IbF3H protein may be expressed in the cytoplasm and without a transmembrane structure. The qRT-PCR experiment showed that the IbF3H gene was not a tissue-specific expressed gene， and the expression level of leaves and stems was higher than that of stem tips and roots. After simulated salt stress treatment， IbF3H gene expression showed a trend of decreasing first and then increasing; after simulated drought stress treatment， IbF3H gene expression was always higher than the control group in response to adversity stress. This study could lay the foundation for the next step to explore the IbF3H gene in regulating the sweet potato flavonoid biosynthesis pathway and function.

Keywords： sweet potato; flavanone 3-hydroxylase gene; qRT-PCR; stress expression

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.06.004

甘薯[Ipomoea batatas （L.） Lam.]属于旋花科、甘薯属的同源六倍体植物[1]，是重要的粮食、饲料、工业原料作物和新型的生物能源作物，且具有极高的营养保健价值[2]。

甘薯中的酚类化合物主要包括酚酸、花色苷和类黄酮3大类[3]。其中类黄酮是植物的次生代谢产物，广泛分布于植物界并具有较强的生物活性[4]。研究表明黄酮类化合物对植物的生长、发育和繁殖尤为重要，也有利于维持人类健康[5-7]。黄烷酮3-羟化酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）是黄酮类化合物合成途径中的一个关键酶，属于依赖2-酮戊二酸的双加氧酶家族[8-9]。F3H催化4，5，7′-黄烷酮C3位的羟基化合成二氢山奈素（dihydrokaempferol，DHK），二氢山奈素是合成黄酮醇、前花色素苷、花青素的重要前体物质，而编码黄烷酮3-羟化酶的F3H基因也是调控植物体内类黄酮代谢物积累的关键功能基因[10]。在辣椒和菊花中F3H基因是花青素代谢和积累途径的关键基因[11-12];阻断拟南芥F3H基因表达可以降低黄酮及花色素含量[13]。目前，F3H基因在许多植物中已经被克隆和研究，比如龙眼[8]、百合[9]、苦荞[14]等。就甘薯而言，黄元射等[15]克隆了紫薯‘渝紫7号中的黄烷酮3-羟化酶基因并分析其氨基酸序列和蛋白三维结构特征;Lalusin等[16]研究发现了甘薯F3H基因在紫色和黄色品种中不同组织部位均有表达，不同发育时期表达情况不同;Hou等[17]研究发现弱光条件下紫肉甘薯贮藏根中与花色苷生物合成有关的IbF3H的mRNA水平受到抑制。对于甘薯F3H基因的生物信息学分析、组织特异性表达、干旱和盐胁迫处理下基因表达情况研究较少。本研究以此为切入点，以前期转录组数据库为基础，筛选出一个与类黄酮生物合成密切相关的基因F3H，以‘福菜薯7-6为实验材料，克隆该基因，并将其命名为“IbF3H”。以生物信息学方法分析该基因的序列和蛋白结构特征，以qRT-PCR方法分析IbF3H基因在不同品种、不同组织及模拟盐旱胁迫处理下基因的表达情况。以期为进一步解析IbF3H基因在调控甘薯类黄酮生物合成途径和功能研究奠定基础。

1  材料与方法

1.1  材料

供试甘薯品种为‘福菜薯7-6‘EC16和‘福菜薯18，均种植于湖北省农科院粮食作物研究所盆栽场。以成熟的‘福菜薯7-6叶片为材料进行基因克隆，取栽后20 d的‘福菜薯7-6和‘EC16的根、茎、茎尖、叶进行qRT-PCR分析，取样时液氮速冻1h后置于–80 ℃冰箱保存备用。

将经胚性愈伤诱导形成的‘福菜薯18再生植株接种于MS固体培养基上，培养条件为：28 ℃，光照条件为2000～3000 lx，16 h光照，8 h黑暗。4周后，取30株长势基本一致的植株，无菌水洗净残留培养基后，移至1/2的霍格兰溶液中驯化培养3 d。驯化后的植株各取15株分别放入含有30% PEG 6000和200 mmol/L NaCl的1/2霍格兰溶液中，分别模拟干旱和盐胁迫处理。盐胁迫处理0、1、6、12 h，干旱胁迫为0、1、6、12、24 h处理，每个处理设置3个重复。将处理后的植株液氮速冻，研磨成粉，置于–80 ℃冰箱保存，用于盐胁迫和干旱胁迫处理后的qRT-PCR分析。

1.2  方法

1.2.1  IbF3H基因的克隆  利用全式金生物技术的通用植物总RNA提取试剂盒提取‘福菜薯7-6叶片总RNA，置于–80 ℃超低温冰箱保存备用，使用TaKaRa的反转录试剂盒反转录成cDNA，–20 ℃保存备用。

基于转录组测序获得的Gene ID在甘薯野生种基因组网站http：//sweetpatato.plantbiology. msu.edu/index.shtml中進行检索，获得该基因的CDS序列。利用Primer 5.0软件在参考序列CDS序列两端设计特异性引物，克隆获得IbF3H基因。反应总体系为50 μL（表1）。克隆PCR反应程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，55 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min，35个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。

利用TaKaRa公司pMD?19-T载体构建IbF3H克隆载体。连接反应总体积为10 μL：pMD?19-T载体1 μL，反应液5 μL，IbF3H的PCR回收产物4 μL，16 ℃连接过夜。将连接产物转化DH-5α感受态细胞，摇菌6～8 h。吸取200 μL转化后的感受态细胞，将其均匀涂抹在含有氨苄霉素（Amp）的LB固体培养基上，37 ℃倒置培养过夜。挑选单克隆摇菌后进行阳性克隆检测，反应总体系为25 μL（表2）。

挑选阳性菌液测序，利用DNAMAN V6.0软件分析序列信息，将测序正确的菌液保存。被保存的阳性菌液进一步增殖，提取pMDTM19- T-IbF3H质粒。质粒PCR反应程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，55 ℃复性35 s，72 ℃延伸90 s，35个循环;72 ℃延伸10 min;4 ℃保存。

1.2.2   IbF3H生物信息学分析  利用相关平台或软件对IbF3H基因进行生物信息学分析，相关生物信息学分析工具见表3。

1.2.3   IbF3H基因的表达分析  ‘福菜薯7-6‘EC16和‘福菜薯18的RNA提取与cDNA反转录参照IbF3H基因克隆的方法。利用Primer 5.0软件设计IbF3H基因的荧光定量特异性引物，以甘薯肌动蛋白β-Actin基因为内参基因，参照TransStart Tip Green qPCR SuperMix试剂盒说明书（全式金生物技术），在荧光定量PCR仪（BIO-RAD）上进行扩增，每个反应3次重复。反应体系如表4所示，荧光定量PCR扩增条件为：94 ℃预变性30 s，94 ℃变性5 s，58 ℃退火30 s，40个循环;溶解曲线设置为65 ℃ 5 s到95 ℃，增量为0.5 ℃。检测IbF3H基因在不同品种、不同组织、不同处理条件下的表达状况，利用2-ΔΔCT法计算出基因的相对表达量。

1.3  数据处理

所有试验数据利用Excel和SAS 8.1统计分析软件进行单因素方差分析（ANOVA），采用Duncan法对处理之间以及同一处理随时间变化的差异性进行多重比较分析。

2  结果与分析

2.1  IbF3H基因的克隆

采用同源克隆的方法，以‘福菜薯7-6叶片RNA为模板，以参考基因组CDS序列设计引物，克隆得到IbF3H，其CDS长度为1107 bp（图1）。

2.2  IbF3H基因的生物信息学分析

IbF3H预测的基因外显子和内含子结构如图2所示，含有3个外显子和2个内含子。选取IbF3H基因上游1500 bp的序列范围进行启动子顺式作用元件预测，结果显示，启动子范围内存在多种类型的启动子顺式作用元件（图3）：（1）光响应元件G-Box、ACE、TCCC-motif;（2）起始子和增强子元件TATA-box，CAAT-box;（3）干旱胁迫响应元件MBS;（4）植物激素响应元件，与脱落酸激素响应相关的ABRE元件;（5）蛋白代谢相关元件O2-site等。上述结果表明，IbF3H启动子可能受光调控，其活性可能受到一些激素和非生物胁迫的调控。

IbF3H蛋白编码368个氨基酸，预测蛋白分子量为41.12 kDa，等电点为5.83。氨基酸序列对比结果显示：甘薯IbF3H与其他物种F3H基因编码的氨基酸序列具有较高的同源性，其中与茑萝、圆叶牵牛、高杯花、栽培茄子同源一致性分别为92.99%、92.45%、83.02%、82.75%，与其他植物的氨基酸序列相似性达到了80%以上（图4）。除此之外，与其他品种甘薯的IbF3H1（GenBank登录号为BAA75309.1）、IbF3H2（ANA53146.1）、IbF3H3（BAA75307.1）氨基酸序列對比一致性分别达到了98.92%、97.04%、96.23%，可见IbF3H蛋白的编码区高度保守，从而进一步证明所克隆的基因确为甘薯F3H基因。

系统进化树分析表明，甘薯IbF3H蛋白与茑萝、圆叶牵牛的关系较近，与枸杞、黑果枸杞等的亲缘关系较远（图5）。

通过PredictProtein平台在线预测结果显示IbF3H蛋白二级结构中有56.79%的无规则卷曲（Random coil）、28.26%的α螺旋（Alpha helix），14.95%的β-折叠（β-sheet）结构构成。可能在第65、170、191、206个氨基酸处存在二硫键。预测结果显示，IbF3H蛋白中可能含有cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N-肉豆蔻酰化位点、酰胺化位点、ATP/GTP结合位点motif A（P环）等功能位点。通过SMART蛋白结构域数据库预测可知，IbF3H蛋白含有非血红素双加氧酶结构域（DIOX-N superfamily）和典型的F3H蛋白功能结构域（2OG- FeⅡ-Oxy加氧酶结构域），属于双加氧酶超家族。

通过TMpred在线软件预测表明，IbF3H蛋白可能不具备跨膜结构（图6）。亚细胞定位预测IbF3H蛋白可能在细胞质中表达。IbF3H蛋白三维结构预测如图7所示，有30.27%的氨基酸与模板蛋白氨基酸相一致，达到了建模的要求（>30%），有36%的相似氨基酸序列结构与模板蛋白覆盖率达到了92%。

2.3  IbF3H基因的表达特性分析

qRT-PCR结果表明（图8），对于甘薯‘福菜薯7-6品种，IbF3H在茎中表达量显著高于茎尖;在‘EC16中，叶的表达量极显著高于根部;IbF3H在甘薯多个组织中均有表达，说明IbF3H并非组织特异性表达的基因。相对而言，叶和茎表达量高于茎尖和根，这可能与甘薯黄烷酮3-羟化酶在不同部位合成和作用有关。

利用200 mmol/L NaCl和30% PEG6000模拟盐胁迫和干旱胁迫处理（图9），IbF3H对NaCl响应是先降低后升高的趋势，在1 h和6 h表达量低于对照组，在12 h表达量高于对照组;在对PEG6000的响应中，处理组一直高于对照，并在24 h时表达量达到最高，极显著高于1、6、12 h。推测IbF3H在盐胁迫和干旱胁迫处理后，参与类黄酮化合物合成，响应逆境胁迫。

3  讨论

随着植物多酚化学和药理学的发展，人们逐渐认识到多酚类次生代谢物质是具有独特生理活性和药理活性的天然产物[18]。F3H基因作为核心类黄酮——花青素途径的关键结构基因之一[19]，越来越受到人们的关注。本研究以‘福菜薯7-6甘薯叶片cDNA为模板，成功克隆出IbF3H基因，其CDS序列为1107 bp，与黄元射等[15]克隆的‘渝紫薯7号F3H基因序列长度一致，与前人在柠条锦鸡儿[20]、百合[9]、苦荞[14]等其他植物上研究相接近。该基因含有3个外显子和2个内含子，编码368个氨基酸，蛋白分子量为41.12 kDa，等电点为5.83。与其他植物的氨基酸序列相似性达到了80%以上，其中与茑萝、圆叶牵牛等相似度较高，达到了90%以上。蛋白序列系统进化分析表明，甘薯IbF3H与茑萝、圆叶牵牛等旋花科植物亲缘关系较近，可见IbF3H的编码区高度保守，且黄烷酮3-羟化酶在进化上具有较高的保守性。IbF3H蛋白二级结构预测显示含有非血红素双加氧酶结构域（DIOX-N superfamily）和典型的F3H蛋白功能结构域（2OG-FeⅡ-Oxy加氧酶结构域），属于双加氧酶超家族。与王海竹等[21]关于醋栗F3H的研究结果一致。预测结果显示IbF3H蛋白可能不具备跨膜结构，并在细胞质中表达，与曹芳芳[22]关于F3H基因总结的规律类似。干旱胁迫下，红砂F3H酶活性随着干旱胁迫处理时间的延长，先升高后降低至处理前水平[23]。枸杞F3H基因的过表达提高了转基因烟草对干旱胁迫的耐受性，提高了转基因烟草的抗氧化酶和黄酮-3-醇的含量[24]。盐胁迫下，不同浓度的盐胁迫均能不同程度地提高枳实生苗中F3H基因的上调表达，进行胁迫响应[25]。过表达茶树F3H基因，可增强转基因烟草的耐盐性[26]。低温、高盐、干旱和高温胁迫均能诱导柠条F3H基因的表达，推测柠条F3H基因参与了非生物胁迫应答[27]。由此可见，当植物受到逆境胁迫时，F3H促进花青素的积累，增强抗氧化能力，从而抵御逆境。qRT-PCR结果表明，IbF3H基因并非组织特异性表达的基因，叶和茎表达量高于茎尖和根，这与张星等[9]、胡晓婧等[10]在百合和茶树中关于LhSorF3H并非组织特异性表达的基因、CsF3H在叶中表达量较高观点一致;模拟盐旱胁迫处理后，IbF3H基因表达量在NaCl胁迫响应中呈现先降低后升高的趋势，在30% PEG6000胁迫响应中表达量一直高于对照组，以响应逆境胁迫。与郑晟等[20]、侯伶俐等[28]在柠条锦鸡儿、苦荞等植物中盐旱模拟处理下F3H基因表达量变化趋势相似。

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责任编辑：黄东杰