通过式固相萃取与液相色谱串联质谱和气相色谱串联质谱结合测定加热卷烟中多种农药残留

杨飞，纪元，刘珊珊*，王颖，范子彦，邓惠敏，边照阳，陈晓水，唐纲岭

1 国家烟草质量监督检验中心，郑州高新技术产业开发区翠竹街6号 450001；

2 浙江中烟工业有限责任公司技术中心，杭州市西湖区科海路118号 310024

近年来，加热烟草制品（HTPs）在市场上的占有率逐年上升，而对于加热烟草制品的研究也逐渐成为当前的热点[1-2]。加热烟草制品是利用特殊热源对由烟丝或其它烟草材料制备的烟芯进行加热（150℃～500℃），产生可吸入气溶胶。加热烟草制品因其无需高温燃烧烟草，仅在相对低温下对烟草原料进行加热，减少了烟草高温燃烧裂解产生的有害成分，但同时增加了某些农药残留的转移风险[3-5]。

蔬菜、水果及烟草等农作物在种植和储藏期间均会普遍施用农药防治病虫害，以提高产量并获得高质量的产品。但是，农作物中的农药残留可能对人类健康产生诸多不利影响。由于农药种类多，性质差异较大，且农药残留含量低，很难采用单一的分析方法对多农药残留进行检测。目前，气相色谱-串联质谱（GC -MS/MS）[6-8]和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）[9-10]已经成为测定多种基质中的多种农药残留的“金标准”。串联质谱（tandem mass spectrometry，MS/MS）由两个或更多的质谱串接而成，最简单的串联质谱由两个质谱串联而成。第一级质谱使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的母离子，母离子经过氮气、氩气等碰撞气碰撞产生碎片离子，碎片离子经过第二级质谱进行质量分析。串联质谱具有高灵敏度和高选择性，是一种分析复杂基质中农药残留的有效手段。

烟草基质复杂，色素、脂质等含量较高，对样品中的痕量农药残留进行分析前，需要进行前处理去除基质干扰以提高方法的灵敏度和特异性。现有分析方法多采用固相萃取（SPE）[6]和QuEChERS[7-10]技术净化样品。但这些方法前处理过程繁琐，耗时长。PRiME（process，robustness，improvements，matrix effects, ease of use）HLB柱是一种新型亲水亲脂平衡萃取柱，其特有的亲脂基团可以有效地吸附烟草中的色素和磷脂类物质。与传统的固相萃取柱相比，PRiME HLB固相萃取柱是一种通过式固相萃取柱，不需要活化/平衡、清洗或洗脱步骤，样品提取液依靠重力通过PRiME HLB柱并收集，杂质被吸附在固相萃取柱上。PRiME HLB通过式固相萃取具有简单、高效、环保且易于操作的优势，尤其适用于复杂样品中分析物的高通量分析[11-15]。

本方法采用PRiME HLB通过式固相萃取净化、液相色谱-串联质谱和气相色谱-串联质谱同时检测加热卷烟中的杀菌剂、杀虫剂和除草剂等53种常见的农药残留，旨在为加热卷烟中多农残的检测提供了准确、便捷、快速的分析平台。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

25个不同品牌的加热卷烟样品全部采购于国外市场。所有样品除去滤嘴和卷烟纸后，将烟丝粉碎，并过2 mm（10目）筛后贮存于棕色玻璃瓶中，4℃下保存。

22种农药的混合标准溶液Ⅰ（100 μg/mL，上海安谱实验科技股份有限公司）；31种农药的混合标准溶液Ⅱ（100 μg/mL，上海安谱实验科技股份有限公司）；内标d4-三唑酮和三苯基磷酸酯（1 mg，纯度大于98.0%，德国Augsburg公司）；乙腈、甲苯和甲酸（色谱纯，德国Merck公司）；无水硫酸镁（MgSO4）、氯化钠（NaCl）、乙二胺基-N-丙基（PSA）（分析纯，上海百灵威科技股份有限公司）；水为超纯水；高纯氮、高纯氩、高纯氦（纯度＞ 99.999%，郑州源正科技）。PRiME HLB通过式固相萃取柱（60 mg，3 cc，美国Waters公司）。

ACQUITY I class超高效液相色谱仪、Xevo-TQS四极杆串联质谱仪（配电喷雾电离源，美国Waters公司）；Agilent 7890B-5977A气相色谱-三重四极杆质谱联用仪（美国Agilent科技有限公司）；ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国Waters公司）；Turbo Vap氮吹仪（美国Biotage公司）；VX200涡旋振荡仪（美国Labnet公司）；SG3-30K高速离心机（德国Sigma公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）；BSA2245-CW电子天平（感量：0.0001 g，德国Sartorius公司）。

1.2 方法

1.2.1 LC-MS/MS用基质匹配标准工作溶液

将1.0 mg内标d4-三唑酮用乙腈溶解并转移至100 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，制得内标工作液Ⅰ（10 μg/mL）。

移取1.0 mL的混合标准溶液Ⅰ于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，制得的质量浓度为10 μg/mL的混合标准储备液Ⅰ。

分别移取混合标准储备液Ⅰ 500、200、100、50、20 μL至5个10 mL容量瓶中，并加入100 μL内标工作液Ⅰ，用超纯水定容，制得质量浓度分别为500、200、100、50及20 ng/mL的标准工作溶液Ⅰ。

分别移取0.2 mL标准工作溶液Ⅰ和0.2 mL空白样品提取液，混合后用超纯水稀释至1 mL，即得到基质匹配系列标准工作溶液Ⅰ。所有溶液避光储存在4℃的冰箱中，使用前将其恢复至室温。

1.2.2 GC-MS/MS用基质匹配标准工作溶液

将1.0 mg内标三苯基磷酸酯用甲苯溶解并转移至50 mL容量瓶中，用甲苯定容至刻度，制得内标工作液Ⅰ（20 μg/mL）。

移取1.0 mL的混合标准溶液Ⅱ于10 mL容量瓶中，用甲苯定容至刻度，制得的质量浓度为10 μg/mL的混合标准储备液Ⅱ。

分别移取混合标准储备液Ⅱ 500、200、100、50、20 μL至5个10 mL容量瓶中，并加入200 μL内标工作液Ⅱ，用甲苯定容，制得质量浓度分别为500、200、100、50及20 ng/mL的标准工作溶液Ⅱ。

分别取5份空白提取液各1 mL，置于氮吹浓缩仪适用的试管中，在氮吹浓缩仪上浓缩近干，再分别加入1 mL不同浓度的标准工作溶液Ⅱ，搅拌复溶，即得到基质匹配系列标准工作溶液Ⅱ。

所有溶液避光储存在4℃的冰箱中，使用前将其恢复至室温。

1.2.3 烟丝样品的提取和净化

称取2 g粉碎后的样品（精确至0.01 g）于50 mL具盖离心管中，加入10 mL水，振荡，让水充分浸润样品。移取10 mL乙腈至离心管中，并加入100 μL内标工作液Ⅰ和200 μL内标工作液Ⅱ，然后将离心管置于涡漩混合振荡仪上以2000 r/min的速率振荡2 min。然后向离心管中加入4 g无水硫酸镁和1 g氯化钠、1 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸二氢钠，立即于漩涡混合振荡仪上以2000 r/min振荡2 min，然后以5000 r/min离心5 min。

移取2.0 mL的上清液到PRiME HLB柱中，且在重力作用下让其自然通过小柱，收集滤液。滤液经0.22 μm有机相滤膜过滤后，移取200 μL用乙腈稀释至1 mL进LC-MS/MS检测。

在上述50 mL的离心管中继续加入5 mL甲苯，涡旋混匀2 min，然后以5000 rpm离心5 min。移取2.0 mL的提取液到PRiME HLB柱中，且在重力作用下让其自然通过小柱，并收集滤液。滤液经0.22 μm有机相滤膜过滤后进GC-MS/MS检测。

1.2.4 空白样品的提取

称取2 g空白样品于50 mL具盖离心管中，加入10 mL水和10 mL乙腈至离心管中，然后将离心管置于涡漩混合振荡仪上以2000 r/min的速率振荡2 min。然后向离心管中加入4 g无水硫酸镁和1 g氯化钠、1 g柠檬酸钠和0.5 g柠檬酸二氢钠，立即于漩涡混合振荡仪上以2000 r/min振荡2 min，然后以5000 r/min离心5 min。

移取2.0 mL的上清液到PRiME HLB柱中，且在重力作用下让其自然通过小柱，收集滤液。滤液经0.22 μm有机相滤膜过滤，该溶液用于制备LC-MS/MS用基质匹配标准工作溶液。

在上述50 mL的离心管中继续加入5 mL甲苯，涡旋混匀2 min，然后以5000 rpm离心5 min。移取2.0 mL的提取液到PRiME HLB柱中，且在重力作用下让其自然通过小柱，并收集滤液。滤液经0.22 μm有机相滤膜过滤，该溶液用于制备GC-MS/MS用基质匹配标准工作溶液。

1.3 实验条件

1.3.1 LC-MS/MS分析条件

ACQUITY UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温：40℃；进样量：2 μL；流速：0.3 mL/min；流动相：A相为乙腈，B相为0.1%（体积分数）甲酸水溶液；梯度洗脱程序：0～0.50 min为10% A，0.50～9.00 min为10% A～100% A，9.00～12.25 min为100% A，12.25～12.35 min为100% A～10% A，12.35～15.00 min为10% A。质谱扫描方式：正离子扫描；离子源：电喷雾电离源（ESI）；离子源温度：150℃；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气流量：800 L/h；锥孔气流量：60 L/h；毛细管电压：2.6 KV；采集模式：多反应监测（MRM）；质谱参数见表1。内标法定量，内标为d4-三唑酮。

表1 分析物的液相色谱串联质谱参数Tab. 1 LC-MS/MS parameters for analytes

续表1

1.3.2 GC-MS/MS分析条件

色谱柱：Agilent HP -5MS 毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；PTV进样口，初始温度70℃，进样后以4℃/s升至280℃；进样量1 μL，不分流进样；载气：氦气，恒流模式，流速为1.2 mL/min；柱温箱升温程序：初始温度为90℃，初始时间为5 min；以25℃/min速率由90℃升至180℃，保持15 min；然后以5℃/min升至280℃，保持6.5 min；然后以40℃/min升至300℃，保持5 min；EI电离模式，电离能70 eV；离子源温度250℃，传输线温度280℃；碰撞气：氮气，0.16 MPa；溶剂延迟：5 min；采集模式：多反应监测（MRM）；质谱参数见表2。内标法定量，内标为三苯基磷酸酯。

表2 分析物的气相色谱-串联质谱参数Tab. 2 GC-MS/MS parameters for analytes

续表2

2 结果与讨论

2.1 净化效果的比对

为验证方法优越性，将PRiME通过式固相萃取的净化效果与PSA分散固相萃取的净化效果[11-12]进行了比较，以基质效应（ME）的大小进行表征。其中，基质效应的计算公式为ME=（基质匹配标准溶液曲线斜率/纯溶剂标准溶液曲线斜率-1）× 100%。ME绝对值越大表明基质效应越强[13]。部分农药基质效应见表3。结果显示，经PRiME HLB柱净化后，大部分农药的基质效应与PSA分散固相萃取方法相当，个别农药的基质效应明显低于PSA分散固相萃取方法。且经PRiME净化后的提取液较PSA分散固相萃取净化后的提取液颜色更浅（如图1）。因此本研究采用PRiME HLB通过式固相萃取柱净化样品。该方法仅需样液上柱，无需活化、淋洗、洗脱等步骤，操作更快捷方便，且PRiME HLB固相萃取柱填料因键合特有亲脂基团，能有效吸附烟草基质中的磷脂、脂肪、色素等干扰物，从而实现样品净化目的。样品经PRiME HLB固相萃取和PSA分散固相萃取后部分农药的选择离子色谱图如图2所示。

表3 不同净化方法基质效应的对比Tab. 3 Comparison of matrix effects of different purification methods

图1 不同净化方法净化效果的对比Fig.1 Comparison of purification effects of different purification methods

2.2 方法对比

为了验证PRiME通过式固相萃取方法的准确性，我们采用YC/T 405.1-2011《烟草及烟草制品 多种农药残留量的测定 第1部分：高效液相色谱-串联质谱法》、YC/T 405.2-2011《烟草及烟草制品 多种农药残留量的测定 第2部分：气相色谱-串联质谱法》和本方法进行了对比实验。烟草行业标准YC/T 405.1-2011、YC/T 405.2-2011采用QuEChERS法对样品进行提取后、使用PSA进行分散固相萃取净化，然后以LC-MS/MS或GC-MS/MS检测。采用本方法与烟草行业标准对2019年和2020年Fapas国际能力验证的4个样品进行检测，结果（表4）显示，本方法检测结果与标准方法检测结果之间无明显差异，说明两种方法的一致性较好。

图2 100 ng/mL的标准溶液中部分农药的选择离子色谱图（A）PRiME通过式固相萃取（B）PSA分散固相萃取Fig.2 MRM chromatograms of some pesticides in 100 ng/mL standard solution (A) PRiME pass-through solid phase extraction (B) PSA dispersive solid phase extraction

表4 不同方法的测定结果对比Tab. 4 Comparison of testing results of different methods

2.3 方法评价

2.3.1 基质效应

由于加热卷烟的烟芯基本上都是采用的再造烟叶，国内外再造烟叶的原料的不同，因此本文分别考察了烤烟、白肋烟和晾晒烟中部分农药的基质效应。如表5所示，GC-MS/MS分析时，基质对大部分农药有显著的增强效应，LC-MS/MS分析时，基质对大部分农药有显著的抑制效应，因此定量分析均需采用基质匹配标准工作曲线。

表5 不同种类样品基质效应的对比Tab. 5 Comparison of matrix effects of different types of samples

2.3.2 标准曲线、检出限和定量限

在优化的色谱、质谱条件下，对配制好的基质匹配系列标准工作溶液Ⅰ和基质匹配系列标准工作溶液Ⅱ分别进行测定，以目标物峰面积和内标的峰面积比为纵坐标（Y），对应的质量浓度值为横坐标（X，ng/mL），绘制标准工作曲线，其线性方程及线性相关系数（r）见表6。可以看出，在20～500 ng/mL 浓度范围内，均能呈现良好的线性关系，其线性相关系数均大于0.9977。将加标空白基质中产生的信噪比（S/N）等于3的浓度定义为检出限（LOD），信噪比（S/N）等于10时的浓度为定量限（LOQ）。如表6所示，LOD和LOQ范围分别在0.31～10.88 μg/kg和1.11～36.21 μg/kg之间。

2.3.3 方法回收率及精密度

采用加标回收实验来测试方法的准确度和精密度，该方法的精密度由重复性实验确定，并以相对标准偏差（RSD）表示。在空白样品中加入总量浓度为0.05、1.0、2.0 mg/kg的混合农药，制备得到3个不同浓度的加标样品，按照上述方法对加标样品进行处理，每个浓度的样品重复测定5次。结果（表6）显示，在所有浓度水平下均获得令人满意的平均回收率（77.36%～108.28%），相对标准偏差（RSD）为1.4%～7.6%。表明该方法准确度高，重复性好，可满足加热卷烟中多种农药残留量的检测需求。

2.4 实际样品的检测

应用所建立的方法对国外生产的25个不同品牌的加热卷烟样品进行检测，所有样品检出杀菌剂，主要是霜霉威和甲霜灵，个别样品检出有多菌灵。其中霜霉威的检出值为0.09～0.45 mg/kg。另外，19批次样品检出杀虫剂吡虫啉，检出值为0.10～0.22 mg/kg。有机磷和拟除虫菊酯类农药未见检出。所有检出值均远低于Coresta制定的农用化学品指导性残留限量。

表6 线性系数，检出限，定量限和精密度Tab. 6 Correlation coefficient, LODs, LOQs and precisions

续表6

3 结论

通过优化质谱条件、色谱条件及样品前处理过程等，建立了LC-MS/MS和GC-MS/MS法结合PRiME HLB通过式固相萃取测定加热卷烟中53种农药残留的方法。在优化后的实验条件下，53种农药的回收率在77.36%～108.28%之间，相对标准偏差在1.4%～7.6%之间。国际能力验证实验结果表明，该方法可以对盲样进行准确的定性和定量分析。该方法定量结果准确可靠，前处理简单快速、时间短，能满足加热卷烟中多种农药残留分析的要求，可用于加热卷烟中农药残留的实际检测。