咽后淋巴结转移鼻咽癌患者血浆EBV DNA和血清EB抗体与预后的关系＊

叶倩，万鑫蕊，宗井凤，陈岩松，崔兆磊，陈燕

[福建医科大学附属肿瘤医院（福建省肿瘤医院）1.检验科，2.放疗科，3.生物化学分子生物学研究室，福建 福州350014]

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）是起源于头颈部的常见恶性肿瘤，好发于东南亚和我国两广、福建等南方地区，其发生、发展与环境、遗传、化学等因素相关[1]。由于其解剖位置深，较难进行早期诊断，非角化性、未分化型为主要类型，与其他头颈部恶性肿瘤相比，NPC 发生淋巴结转移率高，其中咽后淋巴结转移率>70%。咽后淋巴结作为NPC 淋巴结转移的首站，其转移对肿瘤负荷和判断预后有重要临床意义，尤其对总生存率和远处转移生存率有较大影响，但对NPC 预后的影响尚有争议[2]。Epstein-Barr 病毒（EBV）是常见的一种γ 疱疹病毒，与NPC 的发生、发展密切相关。近年来的研究发现，血浆EBV DNA 在NPC 患者疗效监测和预后评价中有重要意义，尤其是治疗前后EBV DNA 浓度的变化对NPC 患者远处转移和局部复发有重要临床意义[3]。单项筛查VCA-IgA敏感性高，VEA-IgA 特异性高，但易导致漏诊和误诊的发生，故联合检测EBV DNA、VCA-IgA、VEA-IgA 对提高NPC 早期诊断的敏感性和特异性具有重要意义[4]。本研究回顾分析所收集病例的临床资料和EB 病毒相关指标，对影响NPC 预后的多种因素进行分析，以期对临床应用提供指导。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月-2015年12月福建省肿瘤医院经鼻咽纤维镜检查、鼻咽病理活检确诊为NPC 的咽后淋巴结转移NPC 患者139 例。其中，男性107 例，女性32 例；年龄19～75 岁，中位年龄47 岁；病理分型以非角化型鳞癌为主，占98.6%（137/139）。根据AJCC分期（第8版）[5]，初诊时Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期患者所占比例分别为3.6%（5/139）、33.1%（46/139）、63.3%（88/139）。

1.2 标本采集

分别抽取治疗前后患者清晨空腹静脉血8 ml。4 ml 于分离胶促凝管中，4 ml 于EDTA 抗凝管中，均室温或2～8℃静置30 min，以3 000 r/min 离心5min，分离得血清和血浆，标本于-20℃冰箱冷冻待检。

1.3 检测方法

血浆EBV DNA 采用qRT-PCR，试剂为中山大学达安基因股份有限公司生产，将待检血浆按照EBV DNA 检测试剂盒操作说明书进行核酸提取：50 μl DNA 裂解液振荡混匀，100℃干浴10 min，以13 000 r/min 离心5 min，各取2 μl 上清液进行PCR反应。反应参数：93℃预变性2 min，93℃变性45 s，55℃退火及延伸60 s，共10 个循环进行预扩增，随后按如下条件进行PCR 扩增：93℃变性30 s，55℃退火及延伸45 s，共30 个循环。同步扩增试剂盒内标准品和质控品，根据标准曲线CT 值由仪器分析软件自动计算各样本病毒拷贝数，>500 copies/ml 定义为阳性，质控品用于监控反应。血清EBV VCAIgA、VEA-IgA 采用酶联免疫吸附试验，试剂盒由德国欧蒙医学实验诊断股份有限公司生产，操作方法按照说明书规范进行，以S/CO>1.1 定义为阳性。

1.4 疗效评价

患者完成治疗计划3 个月后，依据体格检查、鼻咽镜、核磁共振成像等结果进行近期疗效评价，依据世界卫生组织实体瘤评价标准分为完全缓解（complete remission, CR）、部分缓解（partial remission,PR）、稳定（stable disease, SD）和进展（progressive disease,PD）。

1.5 随访

所有患者每周放疗、化疗期间体检，在出院后2年内每3 个月随访1 次，出院后第3～5年每半年随访1 次。随访方式为门诊和电话随访，随访内容包括完善的体检、血液学检查、胸片或胸部CT、腹部超声、纤维鼻咽镜，每半年复查鼻咽MRI，局部或颈淋巴结复发均需病理学诊断证实。

1.6 统计学方法

数据分析采用SPSS 23.0 统计软件。非正态分布的计量资料以中位数和四分位数[M（P25，P75）]表示，比较采用Wilcoxon 秩和检验，两独立样本差值比较采用Mann-Whitney 秩和检验。计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验。Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，比较用Log-rank χ2检验。采用Cox 回归模型进行单因素和多因素分析。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 咽后淋巴结转移NPC患者治疗前EBV DNA、VCA-IgA、VEA-IgA与临床病理特征关系

139 例咽后淋巴结转移NPC 患者在治疗前EBV DNA、VCA-IgA、VEA-IgA 的阳性检出率分别为95.7%（133/139）、93.5%（130/139）、59.7%（83/139）。不同T 分期、N 分期和临床分期的EBV DNA 浓度比较，差异有统计学意义（P<0.05）。不同临床分期VCA-IgA 浓度和VEA-IgA 浓度比较，差异有统计学意义（P<0.05），不同年龄、性别的EBV DNA 浓度、VCA-IgA 浓度和VEA-IgA 浓度比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 各临床病理特征咽后淋巴结转移NPC患者治疗前EBV DNA、VCA-IgA、VEA-IgA水平比较 M（P25，P75）

续表1

2.2 咽后淋巴结转移NPC 患者治疗前后EBV DNA、VCA-IgA、VEA-IgA水平的变化

咽后淋巴结转移NPC 患者治疗前后血浆EBV DNA 浓度比较，差异有统计学意义（P<0.05），治疗前后VCA-IgA 浓度和VEA-IgA 浓度比较，差异无统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 咽后淋巴结转移NPC患者治疗前后EBV DNA、VCA-IgA、VEA-IgA水平比较 [n=139，M（P25，P75）]

2.3 咽后淋巴结转移NPC 患者治疗前后EBV DNA、VCA-IgA、VEA-IgA 的变化与临床疗效的关系

根据治疗后的临床转归，将139 例患者分为缓解组（CR、PR）和进展组（SD、PD），其中缓解组占63.31%（88/139），进展组占36.69%（51/139）。两组治疗前后EBV DNA 差值比较，差异有统计学意义（P<0.05），VCA-IgA 和VEA-IgA 差值比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

表3 两组治疗前后EBV DNA浓度、VCA-IgA浓度和VEA-IgA浓度的差值比较 M（P25，P75）

2.4 咽后淋巴结转移NPC患者生存率分析

所有患者自确诊之日进行随访观察，死亡患者随访至死亡日，存活患者随访至2019年3月截止，中位随访时间51 个月（3～63 个月），计算患者的生存率。本研究81 例预后良好，44 例死亡，14 例失访，失访率为10.07%。经MRI、CT 以及组织病理学方法证明33 例进展，11 例局部复发，51 例远处转移，其中8 例骨转移，6 例肺转移，4 例肝转移，33 例多部位转移。咽后淋巴结转移NPC 患者4年总生存率为72.7%，T1期、T2期、T3期、T4期的4年总生存率分别为89.5%、80.8%、71.4%、59.6%，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=43.395，P=0.000）（见图1）。无远处转移患者和远处转移患者4年生存率分别为87.3%和51.3%，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=11.282，P=0.001）。远处转移患者和未远处转移患者的中位生存时间分别为32 个月和46 个月，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=7.318，P=0.007），远处转移组低于未远处转移组（见图2）。缓解组和进展组4年生存率分别为85.6%和31.8%，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=16.764，P=0.001）。缓解组和进展组中位生存时间分别为48 个月和31 个月，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=10.253，P=0.003），缓解组高于进展组（见图3）。无复发患者和复发患者4年生存率分别为72.6%和61.9%，经χ2检验，差异有统计学意义（χ2=9.573，P=0.004）。无复发患者和复发患者的中位生存时间分别为44 个月和28 个月，经Log-rank χ2检验，差异有统计学意义（χ2=9.154，P=0.004），无复发患者高于复发患者（见图4）。

图1 不同T分期生存曲线

图2 远处转移生存曲线

图3 进展生存曲线

图4 局部复发生存曲线

2.5 咽后淋巴结转移NPC 患者预后的影响因素分析

利用Cox 回归模型对血清VCA-IgA、VEA-IgA 及EBV DNA 表达及其他临床病理特征进行单因素分析，结果表明：T 分期[=1.849（95% CI：1.324，3.032）]、N 分期[=1.651（95% CI：1.221，2.483）]、临床分期[=1.672（95% CI：1.371，1.961）]、EBV DNA水平[=5.324（95% CI：3.442，7.879）]、颈部淋巴结转移侧数[=1.565（95%CI：1.203，2.634）]、颈部淋巴结最大直径[=1.976（95% CI：1.547，3.538）]及远处转移[=1.346（95% CI：1.054，2.264）]是影响预后的主要因素（P<0.05），而性别、年龄、病理分型、分化程度、VCA-IgA 及VEA-IgA 差异无统计学意义（P>0.05）。见表4。

表4 影响咽后淋巴结转移NPC患者预后的单因素分析参数

以生存结局为因变量，将单因素分析有统计学意义的T 分期、N 分期、临床分期、EBV DNA 水平、颈部淋巴结转移侧数和最大直径以及远处转移作为自变量，纳入多因素Cox 回归模型分析，结果表明：临床分期[=2.162（95% CI：1.130，3.215）]、EBV DNA 水平[=2.324（95% CI：1.242，5.529）]、颈部淋巴结转移侧数[=3.012（95% CI：0.653，5.564）]是影响NPC 生存率的危险因素（P<0.05）。见表5。

表5 影响咽后淋巴结转移NPC患者预后的多因素分析参数

3 讨论

NPC 是我国南方地区高发的常见头颈部恶性肿瘤，随着医疗水平的提高，NPC 的5年生存率有较大的进展，但仍有60%～80%[6]，NPC 的淋巴结转移率高，而咽后淋巴结是NPC 转移的首站淋巴结，是判断NPC 的预后和远处转移情况的重要影响因素[7]。本研究发现入组患者EBV DNA 比VCA-IgA 和VEA-IgA 阳性率高，且VCA-IgA 较VEA-IgA 高，T分期、N 分期和临床分期越大，EBV DNA 的拷贝数越高，与CHAN 等[8]报道一致。杜云等[9]报告VCAIgA、VEA-IgA 抗体水平随着临床分期的增大而升高，与本研究结果一致。

对治疗前后分析发现，治疗后EBV DNA 浓度显著下降，VCA-IgA、VEA-IgA 抗体水平无差，表明EBV DNA 对疗效观察更加敏感且优于VCA-IgA、VEA-IgA，大部分NPC 患者治疗后血清中仍然有较高滴度的抗体，可能与其在血清中的半衰期较长有关，与李仕伟等[10]报道相似。缓解组和进展组EBV DNA 治疗前后对数值差值比较有差异，而VCA-IgA、VEA-IgA 治疗前后差值比较无差异，提示EBV DNA 对肿瘤负荷、近期疗效评估有重要意义，与陈岩松等[11]和令狐颖等[12]报道一致，同时也进一步说明EBV DNA 对于疗效评估优于VCA-IgA、VEA-IgA。

本研究预后因素分析提示EBV DNA 与患者生存时间相关，与CHEN 等[13]的研究结果相似，而VCA-IgA、VEA-IgA 与患者的生存时间无明显相关，与其他学者研究结果一致[14-15]。EBV DNA 比VCA-IgA、VEA-IgA 更适用于NPC 患者的预后判断，可能与VCA-IgA、VEA-IgA 在血清中高滴度持续时间长有关。陈贤明等[16]报告不同性别的生存率比较，差异无统计学意义，与本研究结果一致。对年龄单因素分析提示年轻患者的生存率比老年患者高，但差异无统计学意义，分析原因可能与老年病人存在基础病、免疫力低下、对放疗或化疗的耐受能力差有关，不同于HE 等[17]研究结果。

宗井凤[18]报告T 分期是NPC 预后的一个重要因素，且随着T 分期越高肿瘤的预后也更差，有学者报道N 分期、颈部淋巴结转移部位、颈部淋巴结侧数和颈部淋巴结最大直径是NPC 远处转移和预后的危险因素[19-20]，与本研究结果相似。刘波等[21]和HUANG 等[22]提出NPC 患者咽后淋巴结转移是影响N 分期的重要因素，与NPC 预后和远处转移密切相关，本文发现咽后淋巴结转移NPC 患者N 分期较大，预后也较差。

综上所述，EBV DNA 对NPC 患者有重要临床意义，动态观察三项指标水平对于局部复发和远处转移有明显的预测作用，其中EBV DNA 载量变化较VCA-IgA、VEA-IgA 水平变化更敏感，疗效和预后监测价值优于VCA-IgA、VEA-IgA，探讨预后影响因素对NPC 的治疗和提高生存率具有重要意义，三项指标联合检测可为咽后淋巴结转移NPC患者的疗效监测、预后判断和个体化治疗提供帮助。