6-甲基香豆素对乙型肝炎病毒转录和复制的影响*

齐晓娅，钟 珊，王 晴，白瑞雪，陈 曜△

[1.重庆医科大学附属第二医院健康管理(体检)中心 400010；2.重庆医科大学附属第二医院感染病科 400010；3.重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室 400010]

乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒科家族中的一员，其感染已经成为严重的公共卫生问题。据统计，全球约3.5亿人为HBV慢性感染者，每年约有78.6万人死于HBV感染所致的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌等严重疾病[1]。目前被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于慢性乙型肝炎(CHB)治疗的药物为干扰素α(IFN-α)及5种核苷(酸)类似物。IFN-α可以通过免疫调节发挥其抗病毒作用[2]，但因其应答率低，不良反应明显且价格昂贵等缺点，使用范围受到限制[3]。核苷(酸)类似物作为首选的抗病毒治疗药物，具有较强地抑制病毒DNA的能力[2]。但是核苷(酸)类似物需长期服药，可能导致HBV聚合酶变异而引起耐药，限制了其发展[4]。目前，现有的药物均不能有效且全面地抑制HBV复制和HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)的形成。因此迫切需要研发具有全新作用机制和作用靶点的抗HBV药物来解决这一问题。

香豆素类化合物是广泛存在于自然界的一类芳香族化合物，分布于许多花草植物中。研究表明，香豆素类化合物具有多种生物学活性，如:抗艾滋病[4]、抗癌[5]、抗炎、抗凝血等。有文献报道，多种香豆素类化合物在保肝、护肝及抑制HBV感染中起重要作用。7,8-二羟基-6-甲氧基香豆素是从秦皮中提取的天然产物，具有显著的肝保护和抗纤维化作用[6]。扶芳藤中分离出的香豆素类化合物七叶亭(esculetin)在体内外均可有效抑制HBV复制[7]。龙葵提取物香豆素(东莨菪内酯)和酰胺[N-(对-反-香豆酰基)]酪胺对HBV感染的肝癌细胞中的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)分泌有阻断作用，说明香豆素类化合物生物碱具有抗HBV活性[8]。6-甲基香豆素(6-Methylcoumarin)属于香豆素类化合物，常作为香料或添加剂，在化妆品、杀蚜剂、烟用添加剂等领域使用。随着研究的深入，6-甲基香豆素在医疗领域的潜在价值被发现。6-甲基香豆素作为光敏剂，是人和豚鼠光敏性接触性皮炎的重要诱因，紫外线在此过程中起催化作用[9]。同时，6-甲基香豆素可以作为模板分子参与分子印迹聚合物微球与共聚微球的制备[10]。更重要的是，6-甲基香豆素在抑制细胞生长及抗癌方面发挥了重要作用。有文献报道马缨丹鲜叶水提物中的6-甲基香豆素是抑制水葫芦生长的重要化合物[11]。6-甲基香豆素对人食管癌Ec-109细胞的增殖和迁移有抑制作用，且其联合紫杉醇后，抑制作用更为显著[12]。然而，6-甲基香豆素在HBV感染中的作用尚未有研究报道。

本研究采用HBV稳定表达细胞系HepG2.2.15细胞和HBV感染细胞模型HepG2-NTCP细胞及HBV转基因小鼠模型，研究6-甲基香豆素在HBV转录和复制中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

HepG2.2.15细胞购自美国ATCC公司；HepG2-NTCP细胞由重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室保存；胎牛血清，DMEM 高糖型培养基购自美国Gibco公司；青霉素-链霉素购自美国Hyclone公司；6-甲基香豆素购自美国Sigma公司；MTT试剂购自中国生工生物公司；TRIzol、逆转录试剂盒、血清病毒基因组DNA提取试剂盒、基因组DNA提取试剂盒购自中国天根生化科技公司；SYBR GREEN购自美国Bio-Rad公司；ELISA检测试剂盒[HBsAg和乙型肝炎e抗原(HBeAg)]购自上海科华生物工程股份有限公司；SPF级HBV转基因小鼠(C57BL/6)，雄性，体重(17±2)g，6～8周龄，由厦门大学提供；丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1细胞培养

HepG2.2.15细胞培养于含10%胎牛血清、400 μg/mL G418的DMEM培养基中，HepG2-NTCP细胞培养于含有10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中。以上细胞均在含5% CO2、37 ℃的孵箱中培养。分别设置阴性对照组、实验组和阳性对照组，分别采用含0.1% DMSO的生理盐水(阴性对照组)，不同浓度的6-甲基香豆素(5、10、20 μmol/L，实验组)和采用25 nmol/L的恩替卡韦(阳性对照组)进行处理，6 d后检测HBV相关指标。

1.2.2HepG2-NTCP细胞感染HBV

取2.5×105个/孔的HepG2-NTCP细胞接种于12孔板中。培养1 d后，换为感染培养基。感染培养基处理1 d后，进行感染，感染复数为1 000。感染后1 d，PBS清洗细胞3次，洗去残留病毒颗粒，并进行药物处理。

1.2.3动物实验

HBV转基因小鼠饲养于SPF级环境。选取15只体重及HBV DNA拷贝数相近的雄性小鼠分为对照组(0.1% DMSO的生理盐水组)，实验组(6-甲基香豆素组)和恩替卡韦(ETV)组(阳性对照组)，每组5只。3组分别为6-甲基香豆素溶于DMSO，并用生理盐水稀释1 000倍。通过预实验确定实验组(6-甲基香豆素组)给药剂量为5 mg，阳性对照组(ETV组)给药剂量为0.02 mg，阴性对照组注射含0.1% DMSO的生理盐水，采用腹腔注射的方式给药，每2天给药1次，每6天采血及称重1次。24 d后处死小鼠，解剖并收集肝脏。

1.2.4MTT法检测6-甲基香豆素的细胞毒性

将2×104个/孔的HepG2.2.15细胞和HepG2-NTCP细胞接种于96孔板，培养1 d后，加入不同浓度的6-甲基香豆素(倍比稀释，从200 μmol/L至1.56 μmol/L)处理，每3 天更换1次含药培养基。6 d后，每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，避光培养4 h。去除上清液，每孔加入100 μL DMSO充分溶解，酶标仪测定490 nm处的吸光度(A)值。

1.2.5RT-qPCR检测HBV RNA表达水平

使用TRIzol法提取细胞和小鼠肝脏组织的总RNA，取1 μg总RNA进行反转录，得到cDNA。RT-qPCR检测HBV RNA的表达水平，β-actin为内参。HBV RNA上游引物序列为5′-ACC GAC CTT GAG GCA TAC TT-3′，下 游 引 物 序 列 为5′-GCC TAC AGC CTC CTA GTA CA-3′；内参 β -actin上游引物序列为 5′-CTC TTC CAG CCT TCC TTC CT-3′，下 游 引 物 序 列 为5′-AGC ACT GTG TTG GCG TAC AG-3′。实验设置3个复孔并重复3次。

1.2.6RT-qPCR检测HBV DNA表达水平

0.5 mL裂解缓冲液[10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)、1 mmol/L EDTA、1% NP-40和2% sucrose]于37 ℃裂解细胞15 min，离心去除细胞碎片；加入5 μL的1 mol/L MgCl2和4 μL的 1×105U/L DNase Ⅰ，37 ℃孵育4 h；加入200 μL 35% PEG-8000，冰浴1 h；4 ℃ 12 000×g离心5 min，弃上清液；加入500 μL蛋白酶K消化液[0.5% SDS、150 mmol/L NaCl、25 mmol /L Tris-HCl (pH 8.0)和10 mmol /L EDTA]和终浓度为500 mg/L的蛋白酶K，45 ℃孵育过夜后进行酚氯仿抽提，异丙醇沉淀，70%乙醇洗涤，最后使用ddH2O溶解HBV DNA。

小鼠血清HBV DNA提取按照血清病毒基因组DNA提取试剂盒说明书进行；小鼠肝脏组织HBV DNA提取按照基因组DNA提取试剂盒说明书进行。细胞中HBV DNA的上游引物序列为5′-CCT AGT AGT CAG TTA TGT CAA C-3′，下游引物序列为 5′-TCT ATA AGC TGG AGG AGT GCG A-3′；小鼠血清和肝脏组织中HBV DNA的上游引物序列为5′- CCT CTT CAT CCT GCT GCT-3′，下游引物序列为5′-AAC TGA AAG CCA AAC AGT G-3′。实验设置3个复孔并重复3次。

1.2.7ELISA检测HBsAg和HBeAg表达水平

ELISA试剂盒检测细胞上清液和小鼠血清中HBsAg和HBeAg的表达水平。药物处理后，在指定时间收集细胞上清液和小鼠血清，按照说明书进行检测，用酶标仪测定450 nm处A值。

1.2.8酶标法检测血清AST和ALT

小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平采用酶标法(赖氏法)检测。试剂盒购自江苏建成生物工程研究所，ALT检测试剂盒(货号：C009-2)和AST检测试剂盒(货号：C010-2)。将全血标本1 000 r/min离心10 min，分离血清；血清样品与基质缓冲液在37 ℃下混合30 min；然后加入显色液2，4-二硝基苯肼在37 ℃孵育20 min；随后加入终止液0.4 mol/L NaOH，室温静置5 min，酶标仪测定510 nm处A值。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 6-甲基香豆素对细胞活性的影响

6-甲基香豆素在HepG2.2.15和HepG2-NTCP细胞中的CC50>200 μmol/L，见图1。

2.2 6-甲基香豆素对HepG2.2.15细胞中HBV转录和复制的影响

6-甲基香豆素呈浓度依赖性地抑制HepG2.2.15细胞中HBV DNA和HBV RNA的水平，20 μmol/L浓度的6-甲基香豆素对HBV DNA和HBV RNA的抑制率分别为48.33%(图2A)和58.87%(图2B)；ETV能够显著抑制HBV DNA水平，但对HBV RNA无明显影响。6-甲基香豆素呈浓度依赖性地降低HepG2.2.15细胞培养上清液中HBsAg和HBeAg的水平，20 μmol/L浓度的6-甲基香豆素对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为38.33% (图2C)和31.67% (图2D)；ETV组HBsAg和HBeAg水平变化差异无统计学意义。

2.3 6-甲基香豆素对HepG2-NTCP细胞中HBV转录和复制的影响

6-甲基香豆素能够显著抑制细胞中HBV DNA和HBV RNA的表达，20 μmol/L的6-甲基香豆素对HBV DNA和HBV RNA的抑制率分别为41.67%和45.33%；ETV同样能够显著抑制HBV DNA水平，而对HBV RNA无明显影响。同时，ELISA实验证实，6-甲基香豆素可有效降低HepG2-NTCP细胞上清液中HBsAg和HBeAg的表达水平，20 μmol/L的6-甲基香豆素对HBsAg和HBeAg的抑制率分别为29.67%和37.00%；ETV组HBsAg和HBeAg的水平无明显变化，见图3。

2.4 6-甲基香豆素对HBV转基因小鼠的抗病毒效能

3组小鼠体重未出现异常的增高或降低(图4A)，ALT、AST均无明显变化(图4B、C)。与对照组相比，试验组小鼠血清中HBV DNA的拷贝数减少，且抑制效果随着时间的延长而增强；ETV组小鼠血清中的HBV DNA拷贝数降低(图4D)。与对照组相比，试验组血清中HBsAg和HBeAg的水平持续降低，抑制率分别为51.80%和42.80%，而ETV组HBsAg和HBeAg水平变化不明显(图4E、F)。与对照组相比，试验组和ETV组肝脏组织HBV DNA均被明显抑制(图4G)，试验组对HBV RNA的抑制率为49.80%，而ETV组HBV RNA水平无明显变化(图4H)。

A：HepG2.2.15细胞；B：HepG2-NTCP细胞。

A、B：RT-PCR检测HBV DNA和HBV RNA的表达水平；C、D：ELISA检测细胞上清液中HBsAg and HBeAg的表达水平。

A、B：RT-PCR检测HBV DNA和HBV RNA的表达水平；C、D：ELISA检测细胞上清液中HBsAg and HBeAg的表达水平。

A：时间-体重曲线评估毒性作用；B、C：血清AST、ALT水平；D：RT-PCR检测小鼠血清中HBV DNA的表达水平；E、F：ELISA检测小鼠血清中HBsAg和HBeAg的表达水平；G、H：RT-PCR检测小鼠肝脏组织中HBV DNA和HBV RNA的表达水平。

3 讨 论

在HBV生活周期中，HBV病毒颗粒通过NTCP受体内化入胞，脱去衣壳生成rcDNA，rcDNA进一步被修复形成HBV复制模板即HBV的cccDNA，cccDNA转录生成4种不同大小的HBV RNAs，其中3.5 kb RNA可作为模板逆转录形成HBV DNA[13]。为开发新型的抗HBV药物，需要选择真实反映体内HBV生活周期且操作简易的HBV复制细胞模型和动物模型。本研究结果显示，6-甲基香豆素可呈浓度依赖性的抑制HepG2.2.15细胞和HepG2-NTCP细胞中HBV DNA和HBV RNA的表达水平，同时可以降低细胞上清液中HBsAg和HBeAg的水平。表明6-甲基香豆素在体外可显著抑制HBV生活周期中的转录和复制过程。随后，在HBV转基因小鼠中对6-甲基香豆素的抗HBV效能进行验证。结果显示，6-甲基香豆素可以显著抑制小鼠血清中HBV DNA、HBsAg和HBeAg，以及小鼠肝脏组织中HBV DNA和HBV RNA的表达水平，且呈时间依赖性。这些结果充分证实6-甲基香豆素在HBV转录和复制中发挥了重要的负向调节作用，表明6-甲基香豆素具有良好的治疗HBV感染的应用前景。

由于香豆素类化合物具有分子量小，合成简单，生物利用度高，药理作用广泛，毒性小等特点，近年来已经成为许多药物研发工作的研究重点。有相当数量的香豆素类化合物被报道具有抗HBV活性，且机制各不相同。扶芳藤中分离出的香豆素类化合物七叶亭，以剂量依赖的方式抑制HBx蛋白的表达，在体内外均可有效抑制HBV复制[7]。龙须草提取物6-羟基-7-甲氧基-香豆素在无细胞毒性的条件下显示中等抗HBV活性，降低HBsAg和HBeAg水平，但6，7二甲氧基-香豆素没有显示抗HBV活性。从构效关系的角度来看，C6羟基的甲基化降低或消除了抗HBV活性，说明C6羟基在香豆素的抗HBV活性中起重要作用[14]。双香豆素为天然香豆素的衍生物之一，具有较强的抗HBV效应。双香豆素可以降低细胞内HBV RNA、HBV DNA，甚至能降低HBV感染细胞中cccDNA的水平，但不影响HBV的吸附/进入[15]。目前6-甲基香豆素的研究报道较少，作用机制尚未明确。本研究显示6-甲基香豆素在HBV转录和复制中发挥了重要的负向调节作用，且6-甲基香豆素对HBV RNA的抑制作用更为明显。