大鼠来源骨髓MSCs联合嗅鞘细胞在大鼠脊髓损伤模型中的有效性分析

陈传杰，朱立娟，陈佳子，于洋

（承德市中心医院 骨科，河北 承德 067000）

0 引言

脊髓是人以及脊椎动物神经系统以及运动系统必不可少的一部分，一旦发生损伤预后较差，损伤面以下的肢体，其运动与感觉能力都将很难恢复[1]。现阶段关于脊髓损伤的治疗手段中，细胞移植是当下的研究热点之一。研究人员逐渐将视线放在嗅鞘细胞(OECs)与骨髓间充质干细胞（MSCs）上。为探究在脊髓损伤中应用鼠来源骨髓MSCs联合嗅鞘细胞治疗方案的疗效，本研究构建脊髓损伤大鼠模型，并将联合培养的两种细胞注射入大鼠体内。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择本研究中心饲养的8周大SPF级SD雌性大鼠30只，体重范围在200～300g之间。饲养在IVC独立送风系统中，光照与黑暗按照12h的规律交替，相对湿度45%左右，室温21℃～24℃。本研究得到医院伦理委员会的批准。

1.2 方法

（1）大鼠脊髓损伤模型的构建：30只8周大SPF级SD雌性大鼠，采用75%乙醇对手术区域的皮肤进行消毒处理，用3%水合氯醛对大鼠进行麻醉后，将大鼠以俯卧位固定在实验室自制的恒温固定板上。备皮后用碘伏对大鼠背部进行消毒处理。用剪刀在背部的正中位置做一个宽约4cm的纵行切口，切开皮肤、皮下肌肉与脊柱旁的肌肉，将第九与第十胸椎椎板间的黄韧带剪开，剔除第九胸椎的椎体与椎板，使得对应平面的脊髓暴露在视野中，使用特制的镊子把脊髓钳夹15s后松开镊子，用灭菌生理盐水对手术区域的血液进行清洗后，缝合伤口后局部涂抹抗生素防止感染[2]。

（2）提取大鼠骨髓MSCs：选择健康的雄性8周SD大鼠，颈椎脱臼处死，用75%酒精消毒过后转移至超净工作台中，分离大鼠的股骨，用PBS冲出股骨中的骨髓。离心后取沉淀物进行贴壁培养，培养条件37℃，5%CO2，显微镜下观察，当细胞增殖到70%～80%时即进行传代。加入PBS冲洗干净培养液后，加入适量胰酶消化，当细胞恢复圆球形态后加入新鲜培养液，终止消化。低速离心后取沉淀，加入新鲜培养液，吹打混匀后分入不同的培养瓶中，继续培养[3]。

（3）提取嗅鞘细胞：上一步中处死的大鼠，从其枕骨大孔处剖开露骨，将大脑与鼻骨去除后，暴露鼻腔，取出鼻中隔，保留近端三分之一，在解剖显微镜下将上皮组织剥离并清洗后分离原代细胞，经鉴定后为嗅鞘细胞的继续培养。

（4）将骨髓间充质干细胞与嗅鞘细胞按照1∶1的比例混合培养，一周后取培养液，用ELISA法对其中的神经生长因子、神经营养因子-3的表达水平进行检测，所用试剂盒来自上海康朗生物科技有限公司。

（5）模型制作成功后，立即在损伤处注射约5×104个细胞进行治疗，对照组注射等量的PBS，模型组注射单独的骨髓间充质干细胞，研究组注射骨髓间充质干细胞与嗅鞘细胞联合培养的混合细胞。

（6）在术前与手术一周后应用BBB评分系统对三组大鼠的运动能力进行评估。范围0～21分，分数越高表示大鼠的运动能力更强[4]。

1.3 观察指标

分光光度计在450nm出测得吸光度值，借助标准曲线可计算出培养液中的神经生长因子、神经营养因子-3的表达水平。

1.4 统计学方法

收集得到的数据进行分析时使用SPSS 18.0软件，用χ2（%）检验表示其中计数统计，用t检测（）检验表示计量统计，若P＜0.05表明有统计学上的差异，数据可信。

2 结果

2.1 不同培养方法的神经生长因子、神经营养因子-3表达水平的对比

应用不同的培养方法，培养液中神经生长因子、神经营养因子-3表达水平的对比，差异有统计学意义（P＜0.05），但是联合培养的培养液中这两种物质浓度比较居中，适合向大鼠模型体内注射，见表1。

表1 不同培养方法的神经生长因子、神经营养因子-3表达水平的对比（）

表1 不同培养方法的神经生长因子、神经营养因子-3表达水平的对比（）

2.2 三组大鼠模型BBB运动能力评分的对比

手术前，三组大鼠的运动能力，组间差异无统计学意义（P＞0.05），手术后，研究组大鼠的运动能力显著高于其他两组大鼠，组间差异有统计学意义（P＜0.05），见表2。

表2 三组大鼠模型BBB运动能力评分的对比（）

表2 三组大鼠模型BBB运动能力评分的对比（）

3 讨论

脊髓作为中枢神经系统的重要组成部分，尤其是对成年的哺乳动物而言，受伤之后的自我恢复能力很差，脊髓受到损伤以后，其轴突的再生被抑制，因此神经功能很难得到恢复[5]。急性脊髓损伤临床表现为肢体感觉障碍和运动功能受损。急性脊髓损伤致残率和致死率均较高，给患者、家庭和社会带来沉重的负担。目前对于脊髓损伤，尚无统一治疗的金标准。

嗅鞘细胞是目前治疗脊髓损伤的热门研究方向，嗅鞘细胞来源于自体组织，没有免疫排斥反应，而且是目前发现的唯一能够穿越中枢与周围神经边界的胶质细胞。嗅鞘细胞可以分泌大量不同种类的脑源性神经营养因子和支持因子，为神经细胞和轴突再生、重建连接创造良好条件。而骨髓基质干细胞在脊髓损伤中应用目前也是诸多学者的研究方向之一，MSCs在适合环境下可以分化为神经细胞，与邻近神经组织相互作用，产生某些细胞因子（脑源性神经营养因子等），提高神经元存活率、介导轴突生长，也可以分化为血管内皮细胞和神经细胞，有利于受损区神经、血管组织修复。近些年，随着对脊髓损伤的深入研究，人们发现多种神经营养因子的存在能够促使受损轴突的再生[6]。故本研究通过联合培养鼠来源骨髓MSCs和嗅鞘细胞，将两种细胞应用于脊髓损伤大鼠。在对大鼠模型进行手术前，本研究分别对三种细胞，骨髓间充质干细胞，嗅鞘细胞，以及两者的联合培养，对其培养液中神经生长因子、神经营养因子-3表达水平进行检测，以确定向模型体内注射哪种类型的细胞。结果说明，三种类型的细胞培养液中，神经生长因子、神经营养因子-3表达水平差异有统计学意义（P＜0.05），但是联合培养的培养液中这两种物质浓度比较居中，适合向大鼠模型体内注射。

在进行手术前，对三组大鼠模型的运动能力应用BBB评分系统进行检测，三组大鼠的运动能力，组间差异无统计学意义（P＞0.05），手术后，研究组大鼠的运动能力显著高于其他两组大鼠，组间差异有统计学意义（P＜0.05），证明在本研究中采用联合培养的方法对脊髓损伤大鼠模型的运动能力具有一定的恢复作用。

综上所述，骨髓间充质干细胞与嗅鞘细胞联合培养在大鼠脊髓损伤动物模型中取得了一定的疗效，为进一步在脊髓损伤修复的基础研究以及将来的临床实验提供了一定依据。