HBP21抑制胰岛素诱导的PI3K/AKT信号通路机制

朱海珍 王鑫涛 许艳 田仁云 邓日林 王静静 陈生稳 李慧逸

摘   要：磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信号通路在肝细胞癌中处于异常激活的状态，并且促进癌症的发生发展. 在肝细胞癌中，热休克蛋白HSP70結合蛋白21（Hsp70 binding protein 21，HBP21）处于低表达状态，过表达HBP21显著诱发癌细胞发生凋亡. 利用qRT-PCR技术检测肝癌组织中HBP21的mRNA水平，发现癌组织中HBP21的mRNA水平要低于癌旁组织. 用胰岛素处理肝癌细胞Huh7以激活细胞内PI3K/AKT信号通路，采用qRT-PCR技术和蛋白免疫印迹实验检测细胞内HBP21的转录和翻译水平，随着胰岛素处理时间的延长，HBP21的mRNA水平和蛋白水平都呈现下降趋势. 在Huh7内过表达HBP21显著抑制胰岛素诱导的AKT和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）的磷酸化;通过泛素化实验和蛋白免疫印迹实验发现，HBP21不影响AKT的K48及K63位泛素化及人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN）的蛋白水平. 利用抑制剂LY294002处理Huh7细胞，确定HBP21作用于PI3K/AKT信号通路. 进一步研究发现，HBP21不影响IRS1和IRS2的mRNA水平，而是抑制胰岛素受体β亚基（insulin receptor beta，IRβ）的磷酸化进而影响PI3K/AKT信号通路的活化. 在Huh7细胞中，HBP21抑制肝癌细胞中异常活化的PI3K/AKT发挥着重要作用. HBP21在肝细胞癌中的缺失表达，以及其抑制PI3K/AKT信号通路使其有可能成为潜在治疗癌症的靶点.

关键词： HBP21;肝细胞癌;PI3K/AKT/mTOR信号通路;PTEN;酶

中图分类号：Q71                                文献标志码：A

HBP21 Inhibiting Insulin-induced PI3K/AKT Signal Pathway Mechanism

ZHU Haizhen1，2，3?，WANG Xintao1，2，3，XU Yan1，2，3，TIAN Renyun1，2，3，

DENG Rilin1，2，3，WANG Jingjing1，2，3，CHEN Shengwen1，2，3，LI Huiyi1，2，3

（1. College of Biology，Hunan University，Changsha 410082，China;

2. Institute of Pathogen Biology and Immunology，Hunan University，Changsha 410082，China;

3. State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics，Hunan University，Changsha 410082，China）

Abstract：The phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B （PI3K/AKT） signaling pathway is abnormally activated in hepatocellular carcinoma and promotes the occurrence and development of cancer. In hepatocellular carcinoma， the heat shock protein Hsp70 binding protein 21（Hsp70 binding protein 21） is in a low expression state， and overexpression of HBP21 significantly induces cancer cell apoptosis. Using qRT-PCR technology to detect the mRNA level of HBP21 in liver cancer tissues， it is found that the mRNA level of HBP21 in cancer tissues is lower than that in adjacent tissues. Hepatocellular carcinoma cell Huh7 is treated with insulin to activate the PI3K/AKT signaling pathway in the cells， and the transcription and translation levels of HBP21 in the cells are detected by qRT-PCR technology and Western blotting. With the prolonged insulin treatment time， the mRNA and protein levels of HBP21 show a downward trend. Overexpression of HBP21 in Huh7 cells significantly inhibits insulin-induced phosphorylation of AKT and mammalian target of rapamycin（mTOR）;through ubiquitination and western blotting experiments， it is found that HBP21 does not affect AKT K48 and K63 ubiquitination as well as phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten（PTEN） protein levels. The inhibitor LY294002 was used to treat Huh7 cells to confirm that HBP21 acts on the PI3K/AKT signaling pathway. Further research shows that HBP21 does not affect the mRNA levels of IRS1 and IRS2， but inhibits the phosphorylation of insulin receptor beta（IRβ） and affects the activation of the PI3K/AKT signaling pathway. In Huh7 cells，HBP21 plays an important role in inhibiting abnormal activation of PI3K/AKT in liver cancer cells. The lack of expression of HBP21 in hepatocellular carcinoma and its inhibition of PI3K/AKT signaling pathway make it possible to become a potential target for cancer treatment.

Key words：Hsp70 binding protein 21（HBP21）;hepatocellular carcinoma（HCC）;PI3K/AKT/mTOR signaling pathway;phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten（PTEN）;enzymes

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第六大常见恶性肿瘤，位居全球癌症相关死亡的第四位，一般认为肝癌的发生与慢性乙型和丙型肝炎病毒感染、酗酒或饮食中接触黄曲霉毒素有关[1-2]. 像许多其他癌症一样，肝细胞表型逐渐演变为发育不良的肝细胞，最后演变为肝癌，并积累了遗传和表观遗传改变. 尽管人们已经对HCC的发病机制进行了较深入的研究，但涉及HCC发病的详细分子机制仍有待进一步研究.

胰岛素（insulin）与其受体（IR）的结合在哺乳动物细胞中启动了一系列复杂的生物学效应[3]，胰岛素结合并激活IRβ亚单位酪氨酸激酶，使IR底物蛋白磷酸化. IRS1和IRS2这两个主要底物与磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（AKT）通路和Ras-丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路有关， PI3K/AKT通路负责胰岛素的大部分代谢活动，Ras- MAPK通路与PI3K通路协同控制细胞增殖[4-5]. IR可以磷酸化至少6种已知的底物蛋白，它们能够与5种主要形式的PI3K调节亚基相互作用[6-7]. PI3K被IR磷酸化激活后，将磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）磷酸化生产磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3），活化后的PIP3进而激活丙酮酸脱氢酶激酶同工酶1（PDK1），激活后的PDK1发挥蛋白激酶功能，进而激活已知的AKT的3种亚型[8-10].

PI3K/AKT信号通路参与控制细胞生长和增殖，并在不同的癌症类型中表现出结构性激活，PI3K活性受多种癌基因和生长因子受体的刺激，PI3K信号通路的活化被认为是癌症的标志[11-12]. 最近对人类癌症基因组的研究结果显示，在广泛的人类癌症中，PI3K通路的许多成分经常成为种系或体细胞突变的靶点，这些靶点已成为癌症干预治疗最有吸引力的靶点之一[13-14].

热休克蛋白HSP70结合蛋白21（Hsp70 binding protein 21，HBP21）又叫TTC36，是TPR基序家族的新成员，是热休克蛋白70（HSP70）的分子伴侣，研究发现特别是在热和化疗药物治疗等不利条件下，HBP21可以促进细胞凋亡. HBP21作为HSP70的伴侣，可以抑制HSP70与Bax的相互作用，增加Bax蛋白从胞浆到线粒体的转位，进而增加细胞色素c的释放，最终诱导细胞凋亡[15-16].  研究表明，HSP70的上调可以抵抗各种不利条件，并抑制癌细胞的凋亡，促进PI3K/AKT通路的活化[17]. 到目前为止，HBP21是否参与调节PI3K/AKT信号通路尚不清楚.

本文研究了肝细胞癌中低表达的HBP21与肝细胞癌中异常激活的PI3K/AKT信号通路之间的关系，发现HBP21参与调控胰岛素诱导的PI3K/AKT信号通路，此发现或许为未来靶向PI3K/AKT信号通路，治疗癌症提供新的理论依据.

1   材料与方法

1.1   细胞系及细胞培养

Huh7细胞购自American Type Culture Collection; HEK293T细胞购买于武汉博士德公司. Huh7细胞和HEK293T细胞在含有10% 胎牛血清、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、青霉素和链霉素的杜尔贝科改良鹰培养基（dulbeccos modified eagle medium，DMEM）中增殖. 所有细胞系在含5%体积 CO2加湿细胞培养箱中保持37 ℃进行培养. 肝癌组织样品从湖南省肿瘤医院获取.

1.2   實验试剂

DMEM培养基底液（美国Gibco公司），LY294002（10 μmol/mL）抑制剂（美国CST公司），Insulin（100 mIU/mL）（美国CST公司），MG132（美国Sigma 公司），DMSO（美国Sigma 公司），10 × PBS（实验室配置），胰蛋白酶（Invitrogen 公司），免疫沉淀磁珠protein A G（德国Merck 公司），2× Laemmli Buffer（Bio-Rad 公司），β-巯基乙醇（Bio-Rad 公司），Trizol 试剂（Invitrogen 公司），RT-PCR试剂盒（Invitrogen 公司），SYBR Green 定量试剂盒（Taraka 公司），全细胞裂解液RIPA Buffer（Thermo 公司），蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂（德国Merck 公司），mTOR/p-mTOR抗体（美国Santa公司），AKT/p-AKT抗体（美国CST公司），HBP21（英国Abcam公司），PTEN抗体（美国CST公司），IRβ/p-IRβ（美国CST公司），β-actin/Flag/V5（美国Sigma 公司），goat-anti-Mouse/goat-anti-Rabbit（美国Sigma 公司），质粒提取试剂盒（上海生工），胶回收试剂盒（上海生工）.

1.3   实验仪器及材料

CO2恒温细胞培养箱，细胞培养皿（美国Corning），细胞计数板（Bio-Rad 公司），移液管，细菌培养箱，37 ℃恒温水浴锅，37 ℃恒温摇床7500荧光定量仪器，聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF），滤纸，Eppendorf  PCR仪器，Eppendorf 移液枪，化学发光成像仪（Bio-Rad 公司），qRT-PCR 八联管，4 ℃低温高速离心机，电泳槽（Bio-Rad 公司）.

1.4   实验方法

1.4.1   HBP21和AKT质粒的构建与鉴定

从美国国家生物信息中心（National Center for Biotechnology Information Search database，NCBI）找到相关基因的蛋白质编码区（Sequence coding for aminoacids in protein，CDS），利用Primer 5.0软件设计基因的前后引物. 提取Huh7细胞的总RNA，通过逆转录试剂盒将提取的总RNA逆转录成cDNA，按照设定好的程序通过聚合酶链式反应（PCR）仪器扩增目的基因. 通过琼脂糖凝胶电泳实验验证目的基因的特异性，并对凝胶中的特异性条带进行胶回收实验. 对胶回收得到的目的基因与载体（P3xFlag-CMV-vector或PcDNA3.1a-V5-vector）进行双酶切实验，将酶切后的目的基因与载体通过T4 DNA连接酶进行连接得到完整的质粒. 采用感受态细胞（DH5α）对质粒进行转化实验，挑取生长在含有抗生素培养皿上的单个细菌菌落进行扩大培养，通过质粒提取试剂盒将扩大培养的菌落进行DNA提取，对核酸进行酶切与鉴定实验，并提取DNA 送入公司测序. 质粒HA-K48和HA-K63由北京大学蒋正凡教授提供.  HBP21和AKT的前引物和后引物序列见表1.

1.4.2   实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

利用TRizol裂解细胞，按照试剂盒流程提取细胞RNA，通过RT-PCR试剂盒将提取的RNA逆转录成cDNA，参照SYBR Green试剂盒说明书对cDNA样品进行稀释. 每个八连管中加入2 μL cDNA模板、上下游引物各0.2 μL、5 μL SYBR试剂、2.6 μL 去离子水，每个样品做3组重复实验，最后将装有样品的八连管放入仪器内进行定量实验. 定量PCR引物序列见表2.

1.4.3   蛋白免疫印迹实验

处理细胞之前，先用1×PBS清洗细胞2～3遍，清洗完细胞之后，使用含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的全细胞裂解液对细胞进行裂解，细胞裂解在冰上操作，裂解细胞时间为 5 min. 裂解完成之后，利用特有的细胞刮子将细胞从细胞培养皿中刮下，使用移液枪将裂解液全部转入1.5 mL EP管中，冰上静置20 min. 将全细胞裂解液放入提前降温到4 ℃的离心机中，13 200 r/min，离心 15 min. 将蛋白样品与上样缓冲液（2× Laemmli Buffer）同比例混匀，放入金属浴中，100 ℃ 煮5 min，使蛋白发生变性. 利用聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PEG）进行蛋白跑胶实验，不同目的蛋白选用不同的抗体进行孵育，最后利用化学发光成像仪对样品进行曝光处理.

1.4.4   泛素化实验

在HEK293T细胞中转染质粒pV5-vector、pV5-HBP21、pFlag-AKT1、pHA-ub或者pHA-K48O和pHA- K 63O 42 h之后，再用MG132（25 μmol/mL）处理6 h，然后通过蛋白免疫印迹实验分析相关蛋白.

1.4.5   数据分析

采用学生t检验（Student's t-test）对定量数据进行分析，对照组和实验组之间的显著性差异程度可以用P值表示，其中P值小于0.05被认为具有统计学意义. P值小于0.05，用“*”号表示;P值小于0.01，用“**”号表示;P值小于0.001，用“***”表示. 所有的“*”号在图柱中表示实验组和对照组之间有显著性差异.

2   结   果

2.1   HBP21在肝癌组织中低表达

有研究表明，HBP21在癌组织中呈低表达状态，HBP21作为HSP70的伴侣，可以抑制HSP70与Bax的相互作用，增加Bax蛋白从细胞质到线粒体的转位，进而增加细胞色素c的释放，最终诱导细胞凋亡[18]. 为了检测HBP21在肝癌组织中的表达情况，本文收集了9例原发性肝癌与癌旁组织，借助qRT-PCR技术检测样本组织中HBP21基因的mRNA表达水平，发现在肝癌组织中HBP21的mRNA水平明显低于其对应的癌旁组织（虽然第5和第6组的定量数据存在一定的误差，但仍具有统计学意义，癌组织中HBP21的mRNA水平明显低于相对应的癌旁组织），这说明HBP21在肝癌细胞中缺失表达，定量结果如图1（a）所示. HSP70的上调可以抵抗各种不利条件，通过促进PI3K/AKT通路的活化抑制癌细胞发生凋亡[18]. 有研究报道PI3K/AKT信号通路在癌症中经常处于异常激活的状态[2]，因此，推测在肝癌中低表达的HBP21和HSP70一樣参与调控PI3K/AKT信号通路. 胰岛素作为一种生长因子与其受体结合能够激活许多信号分子，其中PI3K/AKT信号通路作为其下游重要的信号通路能够在胰岛素的作用下发生显著性活化[6]. 为研究HBP21与胰岛素诱导的PI3K/AKT信号通路之间是否存在联系，用胰岛素处理Huh7细胞，检测HBP21的mRNA水平和蛋白水平，随着处理时间的延长，HBP21的mRNA水平呈下降趋势，尤其是在处理30 min后，现象更为明显，结果如图1（b）所示. 用胰岛素分别处理Huh7细胞，随着处理时间的延长，HBP21的蛋白水平逐渐降低，尤其是胰岛素处理细胞30 min后，HBP21的蛋白水平下调趋势更为明显，结果如图1（c）所示. 综上所述，肝癌组织中低表达的HBP21可能与胰岛素诱导的PI3K/AKT信号通路之间存在联系.

2.2   HBP21抑制胰岛素诱导的AKT和mTOR的

活化

研究表明，在20%～60%的人类HCC中激活了5个主要途径，包括PI3K/AKT、Myc、Wnt/β-catenin、Hedgehog和Met途径[2]. 胰岛素能激活PI3K/AKT信号通路，胰岛素及其受体在肿瘤发生发展中的作用得到了临床证据的支持，有研究表明，即使低剂量的胰岛素就可促进癌细胞生长[19-20].

为了研究HBP21是否调控肿瘤细胞内的PI3K/AKT信号通路，首先构建HBP21质粒，然后在肝癌细胞Huh7内过表达HBP21质粒，在胰岛素的作用下，研究HBP21对PI3K/AKT信号通路的影响. 在Huh7细胞中转染HBP21质粒48 h后，采用不同时间点用Insulin（100 mIU/mL）处理Huh7细胞，实验发现，随着胰岛素处理时间的延长，AKT Ser473位点的磷酸化逐渐增加，但是转染了HBP21质粒的实验组与对照组相比，胰岛素诱导的AKT的磷酸化明显被抑制，尤其在处理30 min后抑制更加明显，实验结果见图2（a）. 这一实验结果表明，HBP21抑制了胰岛素诱导的AKT磷酸化. 为了研究HBP21是否影响AKT下游mTOR的活化，同样地，在Huh7细胞中过表达HBP21质粒，然后用Insulin（100 mIU/mL）处理细胞，处理时间分别为0 min、15 min、30 min，实验发现，随着胰岛素处理时间的延长，mTOR磷酸化在逐渐增加，但是转染了HBP21质粒的实验组与对照组相比，胰岛素诱导的AKT下游的mTOR磷酸化明显被抑制，尤其在处理30 min后抑制更加明显，实验结果见图2（b）. 这一实验结果表明，HBP21可抑制AKT下游的mTOR磷酸化. 综合以上结果，说明HBP21参与调控胰岛素诱导的PI3K/AKT信号通路的活化.

2.3   HBP21不影响PTEN的蛋白水平及AKT的泛

素化

PTEN作为一种重要的抑癌基因，它可以抑制PI3K/AKT信号通路的活性，PTEN发挥它的作用是通过其磷酸酶活性将磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）变成磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2），因此不能使下游AKT发生磷酸化从而抑制AKT的活化[21-22]. 为了探究HBP21是否通过影响PTEN进而影响AKT的磷酸化，我们在Huh7细胞中过表达HBP21质粒，然后用胰岛素处理细胞，通过蛋白免疫印迹实验发现HBP21对PTEN的蛋白水平并没有直接的影响，实验结果见图3（a）. 已知AKT磷酸化的充分条件首先是要其发生K63位的泛素化激活，而K48位是泛素化降解[23]. 为了验证HBP21对AKT磷酸化影响的具体机制，首先研究了HBP21对AKT的泛素化的影响. 在HEK293T细胞中转染质粒V5-vector 、V5-HBP21、Flag-AKT1、HA-ub、HA-K48O和HA-K63O 42 h，再用MG132（25 μmol/mL）處理6 h后收集蛋白，通过实验发现，HBP21对AKT的K48及K63位泛素化都没有明显的影响，实验结果见图3（b），这说明HBP21对AKT磷酸化的影响并非是对其泛素化的影响. 综合以上结果说明，HBP21并非是通过影响AKT的泛素化以及PTEN的蛋白水平来抑制AKT的活化.

2.4   HBP21 作用于PI3K/AKT信号通路

PI3K是一种激酶，当它被胰岛素诱导激活后，可进一步激活下游的AKT及mTOR. LY294002 是PI3K的高选择性抑制剂，明显抑制PI3K激酶的酶活，使其不能发挥激酶功能[24]. 使用抑制剂处理Huh7细胞，首先在Huh7细胞内转染HBP21质粒44 h，然后用PI3K的抑制剂LY294002（10 μmol/mL）再处理细胞4 h，最后用胰岛素处理细胞30 min. 根据蛋白结果图发现，在胰岛素处理细胞30 min后，AKT的磷酸化水平有明显升高，并且抑制剂能够明显抑制胰岛素诱导的AKT和mTOR的磷酸化，实验结果见图4（a）. 在无胰岛素诱导下，HBP21也可明显抑制AKT的磷酸化，而且抑制剂增强了HBP21对AKT磷酸化的抑制作用，实验结果见图4（b）. 综合以上实验结果，发现HBP21作用于胰岛素诱导的PI3K/AKT信号通路，抑制AKT的磷酸化，因此，推测HBP21对AKT的影响可能是作用于PI3K的上游分子.

2.5   HBP21抑制胰岛素受体IRβ的磷酸化

胰岛素与其受体（IR）的结合在哺乳动物细胞中启动了一系列复杂的生物学效应. 胰岛素结合并激活IRβ亚单位酪氨酸激酶，使IR底物蛋白磷酸化[25]. IRS1和IRS2这两个主要底物与PI3K-AKT通路有关，并且PI3K-AKT通路负责胰岛素的大部分代谢活动[4-5]. 通过前面的实验结果发现HBP21抑制胰岛素诱导PI3K/AKT通路中的AKT磷酸化，推测HBP21可能是通过作用于AKT的上游分子影响AKT磷酸化的影响，因此，主要研究HBP21对该信号通路上游分子IRS1/2和IRβ的影响. 在Huh7细胞中转染HBP21质粒48 h后，再以胰岛素处理细胞30 min，收集细胞RNA，检测IRS1/2的mRNA水平. 通过对荧光定量PCR数据进行分析，在胰岛素处理细胞 30 min后，发现HBP21对IRS1和IRS2的mRNA水平并没有影响，实验结果见图5（a）和（b）. HBP21质粒在Huh7细胞中的过表达效果得到验证，见图5（c），这一结果表明HBP21可能不是通过作用于IRS1和IRS2的mRNA水平影响AKT的磷酸化.

由上述分析可知，推测HBP21可能影响了胰岛素受体IRβ亚基的活性. 为了研究HBP21是否影响AKT上游IRβ的活化，在Huh7细胞中过表达HBP21质粒，然后用胰岛素分别处理0 min、15 min、30 min，实验发现，随着胰岛素处理时间的延长，IRβ磷酸化在逐渐增加，但是转染了HBP21质粒的实验组与对照组相比，胰岛素诱导的AKT上游的IRβ磷

酸化明显被抑制，尤其是处理30 min后抑制更加明显，相应地，HBP21同样抑制了AKT的磷酸化，实验结果见图5（d）. 综合以上实验结果，可以得出结论，HBP21通过抑制胰岛素受体（IRβ）磷酸化，进而影响其下游AKT磷酸化.

3   结   论

通过荧光定量PCR技术检测病人肝癌和癌旁组织中HBP21的mRNA水平，发现肝癌组织中HBP21的mRNA水平异常低于癌旁组织. 用胰岛素处理肝癌细胞Huh7，目的是激活PI3K/AKT信号通路，发现随着胰岛素处理时间的延长，HBP21的mRNA和蛋白水平都呈现低表達趋势. 将体外构建的HBP21质粒转染进Huh7细胞，通过蛋白免疫印迹实验发现，HBP21显著抑制PI3K/AKT信号通路中AKT丝氨酸473位点的磷酸化及AKT下游mTOR的磷酸化. 进一步实验发现，HBP21抑制AKT的磷酸化的功能并不是通过影响PTEN的蛋白水平和AKT的泛素化来实现的. 采用LY294002抑制剂处理Huh7细胞，确定了HBP21作用于PI3K/AKT信号通路. 通过一系列实验发现，HBP21通过抑制胰岛素受体IRβ的磷酸化，进而影响其下游的AKT的磷酸化.

本研究阐述了HBP21抑制PI3K/AKT 信号通路的机制，丰富了HBP21作为抑癌基因的功能，但仍存在一些亟待解决的问题. 例如HBP21是如何影响IRβ的磷酸化;是否存在其他蛋白协同HBP21参与调控PI3K/AKT信号通路;HBP21是否具有磷酸酶的功能，这些问题需要进一步通过实验来解决.

本文的研究为治疗肝癌提供了新的思路，HBP21在肝细胞癌中的缺失表达及其抑制PI3K/AKT的活化有可能成为潜在治疗癌症的靶点.

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