大豆胰蛋白酶抑制剂对工蜂上颚腺脂肪酸分泌能力的影响

陈亚南 吴雨祺 郑火青 胡福良

（浙江大学动物科学学院，杭州 310058）

1 引言

充足的营养是蜂群繁殖和发展的基础，蜜蜂在不同发育阶段所需的营养存在差异[1-3]，这为满足不同发育阶段蜜蜂的营养需要增加了复杂性。为了能够更好地满足蜂群营养需求，也为了降低蜂群饲养成本，市场上出现了花粉替代物。大豆粉是最常用的花粉代替物的主要成分。大豆胰蛋白酶抑制剂是大豆粉中重要的成分之一，能调节大豆蛋白质的合成和分解，并具有抗虫作用[4]，对动物和昆虫的营养吸收具有消极影响[5,6]。研究发现，大豆蛋白酶抑制剂显著性地降低蜜蜂的生存率和咽下腺的发育，但对食物的消耗没有显著影响[7,8]。

上颚腺是位于蜜蜂头部的一对大型囊状外分泌腺体。工蜂上颚腺主要负责蜂王浆中脂肪酸的合成，包括10-羟基-2-癸烯酸（10-HDA）及其前体物质10-羟基-癸酸（10-HDAA），这些物质在幼虫的发育过程及蜂王浆的理化特性中起着重要作用[9,10]。虽然花粉代替物已广泛使用，但对蜜蜂上颚腺的分泌能力方面的研究甚少。本研究通过不同浓度大豆胰蛋白酶抑制剂饲喂笼养工蜂，探究大豆胰蛋白酶抑制剂对蜜蜂上颚腺脂肪酸分泌能力的影响。

2 材料与方法

2.1 实验蜂群的饲养

实验蜂群为意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica），饲养于浙江大学蚕蜂研究所。为了获得特定日龄的工蜂，从实验蜂群中抽取即将出房的封盖子脾，放置于34.5℃±1℃和70%±5%（RH）的恒温恒湿箱内过夜以获取新出房的0日龄工蜂[11]。第二天，将新出房的蜜蜂随机分为5 组，每一组中1 只成熟的蜂王维持正常蜂群的信息素环境[12]。每笼内约有50 只蜜蜂，放置于30.5℃±1℃。每24h 更换新的饲料，以保持蜜蜂饲料的新鲜。本实验进行了3 个蜂群的生物学重复。

2.2 大豆胰蛋白酶抑制剂的饲喂

大豆胰蛋白酶抑制剂溶解于40%（W/W）糖浆中通过注射器饲喂笼养蜜蜂（表1）。

表1 实验室笼养蜜蜂日粮组成

2.3 蜜蜂生存率的测定

实验过程中每24h 记录每组蜜蜂的死亡个数并绘制蜜蜂生存曲线。

2.4 工蜂头部10-HDAA和10-HDA含量的测定

为了评定蜜蜂不同阶段脂肪酸的合成能力，在6、9 和12日龄时，收集每个处理组的10 只蜜蜂，将工蜂的头部分离放置于1.5ml 离心管中，加入1ml 无水乙醇和200μl 的对羟基苯甲酸甲酯乙醇溶液作为内标液，超声15min。然后将乙醇溶剂透过0.22μm 的有机滤膜过滤到2ml 的样品瓶中，放置于75℃烘箱内挥发干乙醇，然后加入1ml 乙醚，充分溶解后再次过0.22μm 的有机滤膜过滤到1ml 的GC 样品瓶，放置于50℃烘箱内挥发。乙醚挥发后，添加400μl 吡啶和50μl BSTFA 后密封（Sigma，Kawasaki，Japan），65℃水浴锅中进行衍生化反应，最后使用GC-FID 测定工蜂头部的脂肪酸含量。

2.5 数据分析

采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。工蜂头部10-HDA 和10-HDAA 含量的比较以及饲养期间工蜂生存率和食物的消耗量，采用单因素方差分析计算差异，P 值＜0.05 认为有统计学意义。所有图形均由GraphPad Prism 7 生成。

3 结果

3.1 生存率

大豆胰蛋白酶抑制剂处理12d 后，与对照组相比，4 个处理组工蜂的死亡率都出现了下降的现象（图1），高浓度处理组的工蜂在饲养前几天显著降低了蜜蜂生存率，其他3 个处理组在6日龄后呈现下降的趋势。

图1 饲喂不同浓度的大豆胰蛋白酶抑制剂工蜂的生存率

3.2 工蜂头部10-HDAA和10-HDA含量

与对照组相比，不同水平的大豆胰蛋白酶抑制剂对笼养工蜂脂肪酸合成能力没有显著性影响。但发现在6日龄时，大豆胰蛋白酶抑制剂处理组提高了工蜂头部的10-HDAA 含量。但是随着饲养时间的增加，处理组对工蜂头部10-HDAA 和10-HDA 含量的影响减弱（图2、图3）。

图2 不同水平大豆胰蛋白酶抑制剂条件下笼养工蜂头部10-HDAA含量

图3 不同水平大豆胰蛋白酶抑制剂条件下笼养工蜂头部10-HDA含量

4 讨论

大豆粉是代用花粉中最常用的原料。前人研究表明，以大豆粉为基础的花粉代用品降低了工蜂寿命和食物消耗量[13]。在腺体发育中代用花粉处理组降低了工蜂咽下腺腺泡，同时不同代用花粉的腺泡大小有一定的差异，但是通过改变营养的组成能够进一步提高代用花粉的营养效果[14]。

在我们的研究中，发现高浓度的大豆胰蛋白酶抑制处理组对笼养工蜂的生存率有降低的作用，这与前人的研究结果相类似[8,9]。代用花粉的使用对蜂王浆生产中重要的咽下腺的发育有显著性影响[7]，同时在蜜蜂的嗅觉方面也有一定的消极影响[15]，这可能是由蜜蜂食物获取的敏感性降低所致。本研究结果显示，不同水平的大豆胰蛋白酶抑制剂对笼养工蜂脂肪酸合成能力没有显著性的影响，但是发现在6日龄时提高了工蜂头部的10-HDAA 含量；随着饲养时间的增加，处理组对饲养工蜂头部10-HDAA 和10-HDA 含量的影响减弱。表明大豆胰蛋白酶抑制剂对工蜂上颚腺分泌能力的影响随着饲养时间的增加而减弱，这个过程具体是如何产生影响的，还需要进一步的研究。