丝蛋白-羟基磷灰石复合材料通过抑制NF-κB/NLRP3促进骨缺损的修复

李石岩，李燕波，曹 雷，郝旭峰，何志良，张 晗，王承阳，高 玥，苏丹妮

(河北省承德市中心医院，河北 承德 067000)

骨具有固有的再生能力，但在许多情况下，仍需要改善骨修复能力的策略。骨再生取决于骨缺损类型。例如，大约10%的骨缺损是不愈合的，不能自发愈合，导致骨组织再生不当和延迟愈合。因此，为了提高骨再生能力，避免上述局限性，人们进行了许多尝试，以开发出合适的由天然或合成生物材料组成的骨结构。一些聚合物由于其生物相容性、可生物降解性、可调节的结构特性和易于制造，因此通常是很好的候选材料。可降解聚合物对于这些类型的修复非常重要，以避免阻碍骨的完全再生，可降解聚合物分为天然聚合物，如海藻酸盐、壳聚糖、胶原蛋白、丝和合成聚合物，包括聚二氧六环酮(polydioxanone，PDS)、聚己内酯(polycaprolactone，PCL)、聚乙醇酸(polyglycolic acid，PGA)、聚乳酸(polylactic acid，PLA)，和聚乳酸-羟基乙酸(poly lactic-co-glycolic acid，PLGA)。近年来，由于其独特的生物相容性、多功能性和生物降解性，天然聚合物在骨组织工程中的应用越来越受到重视。这些类型的聚合物提供了由配体组成的图案良好的结构，这些配体可以与细胞表面受体结合或提供可进入的酶降解位点[2]。

丝素蛋白(silk fibroin，SF)是一种天然纤维聚合物，在生物医学领域有着广泛的应用前景。SF因其具有弹性、柔韧性、生物相容性和生物降解性等优异特性，在骨组织工程领域引起了广泛的关注。近年来，各种各样的研究也集中在天然聚合物和SF在骨修复中的应用。虽然其中一些聚合物具有骨再生的内在能力，但这不足以修复大面积骨缺损。因此，在聚合物基质中加入颗粒有助于改善支架的力学性能和调整支架的地形特征，从而模拟自然骨的结构[3]。

然而，SF必须进行功能化后方可发挥上述作用，否则低成骨能力限制了SF在骨科领域的应用。羟基磷灰石(hydroxyapatite，HA)是一种成熟的生物陶瓷，具有与骨组织相似的性质和良好的生物相容性，是一种可与不同聚合物相结合的生物陶瓷相[4]。然而，HA陶瓷易脆化，限制了其在骨修复中的应用[5]。几种天然聚合物，包括胶原蛋白、明胶、壳聚糖和蚕丝，已与HA结合使用，以促进骨再生[6]。因此，将SF和HA共混，结合了这两种材料作为组织工程骨结构的优异特性，基于SF/HA复合材料用于骨组织再生值得深入探讨。

急慢性炎症在骨修复过程中起着不可缺的作用。炎症细胞(多形核白细胞和单核-巨噬细胞-破骨细胞系细胞)和与骨愈合相关的细胞(间充质干细胞-成骨细胞系和血管系细胞)之间的串扰对骨的形成、修复和重塑至关重要[7]。炎性小体(NOD-like receptor pyrin domain containing 3,NLRP3)是一种细胞内机制，激活的NLRP3可分泌IL-1β和IL-18，继而介导炎症反应。研究表明，抑制NLRP3炎性小体促进糖尿病大鼠牙槽骨缺损愈合[8]。但在SF/HA复合材料应用过程中对NLRP3的作用尚不明确。

本研究旨在探讨丝蛋白-羟基磷灰石复合材料修复兔骨缺损过程中对IL-1β和IL-18的基因表达，及NF-κB和NLRP3的蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1材料:试剂:蛋白定量BCA试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司；RIPA裂解液购自武汉博士德生物工程有限公司；PMSF购自中国碧云天生物技术研究所；离心机(Medifuge公司，意大利)；倒置显微镜(Nikon公司，日本)；HA购自(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)；一抗(p-NF-κB p65,NF-κB p65,NLRP3,β-actin)购自Abcam公司；细胞总RNA提取试剂盒、一步法实时定量荧光聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)试剂盒(TaKaRa公司，日本)。

1.2组织工程骨的制备:购买的桑蚕茧被用来产生丝绸溶液，桑蚕蚕茧在0.2 M Na2CO3中切割脱胶30min，然后在37℃干燥24h，将脱胶纤维溶解在9.3M溴化锂溶液中，在60℃孵育4h，用12 kDa的膜用去离子水透析蛋白质溶液72h，测定丝素浓度为3%(w/v)，在1×磷酸盐缓冲液(PBS)中制备了3%w/v的铝钠溶液，将测定量的HA超声分散在1×PBS的中孵育30min，制备的丝素和HA分散液的最终浓度分别为1%w/v和30%w/w。通过微尖喷嘴将制备的溶液逐滴(5mL/min)添加到0.2 M CaCl2溶液中，尖端在0.2 M CaCl2溶液上方3cm处，将复合材料老化12h以完成离子交换，并在37℃下干燥。

1.3动物模型和实验分组:选择新西兰白兔16只(6周龄，雄性)，体重为2.0～2.2kg。全身麻醉，采用随机数字法分为两组，每组8只，分别为手术+HA组和手术+SF/HA组。手术方式为常规消毒兔右面颈部，沿右下颌骨下缘作弧形切口，逐层分离、暴露右侧下颌骨，并于右侧下颌骨中部截骨，同时去除右侧下颌骨和骨膜，制造15mm长的右侧下颌骨节段性骨缺损模型。两组同时行右下颌骨下缘作弧行切口至去除右侧下颌骨和骨膜，分别给予HA培养制备的组织工程骨和SF表面修饰的HA培养制备的组织工程骨。术后保温至清醒，进行常规饲养48h。

1.4实时定量RT-PCR:术后48h取术区边缘1cm处的骨组织，用TRIzol试剂(Invitrogen)从骨组织中分离总RNA，测定RNA的浓度和纯度，测量了260nm处的吸光率和260/280nm的吸光率(Eppendorf，德国)。然后将RNA反转录成cDNA，用特异性引物进行PCR扩增，计算各组骨组织中RNA的相对表达量。见表1。

表1 实验中所用到的引物

1.5免疫印迹法:用RIPA裂解液和PMSF溶解骨组织。用SDS-PAGE法从各组骨组织中分离出50～60μg总蛋白，并转移到PVDF膜上。用5%脱脂乳封闭细胞膜，然后用抗p-NF-κB p65(1∶500；Abcam)、NF-κB p65(1∶1000；Abcam)、NLRP3(1∶500；Abcam)、β-actin(1∶1000；Abcam)的一抗孵育。用TBST洗涤后，用辣根过氧化物酶结合二抗(1∶5000)孵育膜，并用化学发光系统(ChampChemi；SAGECREATION，北京)观察免疫印迹并拍照，灰度值图像J(NIH，Bethesda，MD)统计。

2 结 果

2.1SF/HA对骨修复状态下IL-1β和IL-18基因水平的影响:与手术+HA组相比，手术+SF/HA组IL-1β的mRNA水平明显从4.56±0.26降低至2.09±0.12(P<0.05)；IL-18的mRNA水平明显从5.08±0.08降低至2.20±0.21(P<0.05)(图1)。

图1 SF/HA对骨修复状态下骨组织中IL-1β和IL-18基因水平的影响

2.2SF/HA对骨修复状态下NF-κB和NLRP3蛋白水平的影响:与手术+HA组相比，手术+SF/HA组p-NF-κB的蛋白水平明显从1.24±0.15降低至0.62±0.03(P<0.05)；NLRP3的蛋白水平明显从1.15±0.04降低至0.61±0.05(P<0.05)(图2)。

图2 SF/HA对骨修复状态下兔骨组织中NF-κB和NLRP3蛋白水平的影响

3 讨 论

骨组织工程为修复骨缺损提供了合适的结构[9]。通过工程生物材料模拟自然组织的结构和组成，如开发无机-有机复合材料，在过去的几十年里引起了人们的兴趣和关注。生物活性玻璃、HA、柠檬酸钙等典型陶瓷材料是骨组织工程的理想候选材料[10,11]。

SF与HA的共混促进了HA沿c轴方向的结晶，并对SF和HA的结构和性能产生了协同作用。HA的成核可以提高SF的分子取向和结晶度。同时，在SF中添加HA可以改善SF的生物学性能和力学性能，HA/SF复合材料与模拟自然骨组织无机和有机相的天然骨结构。因此，将无机和有机材料结合在一种独特的混杂复合材料中可以提高骨组织支架的柔韧性、机械强度和韧性。

骨损伤引起急性炎症反应，有益于骨修复，然而，如果急性炎症反应被抑制、失调，或演变为慢性炎症，可延缓或抑制骨损伤修复。关于SF与HA的共混对骨修复过程中慢性炎症反应的作用，本研究结果表明，与应用HA培养制备的组织工程骨组比较，SF表面修饰的HA培养制备的组织工程骨明显降低IL-1β和IL-18的mRNA水平，以及NF-κB和NLRP3的蛋白表达水平，本研究结果与藻酸盐/HA/SF复合材料作为骨替代物的研究结果一致，植入藻酸盐/HA/SF 4周后，与海藻酸钠组相比较，海藻酸钠/HA/SF支架组缺损部位的骨形成率明显升高，同时海藻酸钠/HA/SF支架具有良好的生物相容性，降解后的移植物周围免疫原性反应减弱或形成巨细胞，肿瘤坏死因子α(TNF-α)在海藻酸钠/HA/SF组的表达水平明显低于海藻酸钠和海藻酸钠/HA组。本研究证明了丝蛋白-羟基磷灰石复合材料通过可能通过抑制炎症反应促进骨损伤修复，其机制可能是通过抑制NF-κB/NLRP3通路的激活，继而减缓该通路介导的炎症反应，具体机制待进一步研究，下一步的研究可着眼于丝蛋白-羟基磷灰石复合材料对骨损伤修复过程中焦亡、自噬、氧化应激等方面的影响，该研究结论提升了丝蛋白-羟基磷灰石复合材料在骨损伤修复中的临床应用价值。