奶牛乳房链球菌的分离鉴定及药敏试验

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（青海省黄南州尖扎县措周乡农牧业技术服务站 811200）

关于奶牛乳房炎致病菌的报道，目前已有80 余种，其中链球菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的发病率超过90%，是威胁奶牛乳房健康的主要病原微生物。链球菌属革兰氏阳性菌，能分泌毒素物质危害人畜健康。奶牛乳房炎链球菌主要包括接触传染性病原体（停乳链球菌、无乳链球菌）和环境性病原体（乳房链球菌），随着抗菌物质的使用和滥用，造成药物治疗无效，因此，需要对不同种类链球菌的生物学特性和药敏谱进行试验分析才能选择正确的药物，提高治疗效果，降低药物残留问题。本文对青海尖扎县地区奶牛乳房炎乳房链球菌进行分离、鉴定和药物敏感试验，为合理选择抗菌药物提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 培养基

普通营养肉汤培养基、链球菌选择性培养基和50ml/L 兔鲜血培养基按实验室常规方法配置。

1.1.2 病料来源

试验所用菌株来自青海尖扎县部分某规模化奶牛场，采集患乳房炎奶牛乳汁并分离到12 株疑似链球菌。

1.1.3 试验药物

表1 试验药物信息

1.2 试验方法

1.2.1 链球菌的分离试验

取12 株疑似链球菌接种到普通营养肉汤培养基进行链球菌富集，在37℃恒温培养箱内培养18～24h，划线接种于链球菌选择性固体平板培养基，在37℃恒温培养箱内培养12～24h，观察菌落形态并挑取表面圆滑、边缘整齐的单菌落到50ml/L 兔鲜血琼脂培养基内，在37℃恒温培养箱内培养12～24h，挑取单菌落进行革兰氏染色、镜检，挑取革兰氏染色阳性且成对或有链状排列的球形菌落到链球菌选择性液体培养基进行纯化培养。

1.2.2 链球菌的鉴定试验

按常规方法对分离纯化培养的12 株疑似链球菌分别进行糖发酵试验（乳糖、海藻糖、麦芽糖、甘露醇）、七叶苷水解试验、马尿酸钠水解试验、过氧化氢酶试验和CAMP 试验[1]，观察和记录试验结果。

1.2.3 链球菌的药敏试验

选择乳房链球菌进行药敏试验：用吸管吸取50ul 乳房链球菌纯培养液到固体平板培养基中，用L 棒涂布均匀，加盖室温静置5min 待菌液干燥后，用镊子夹取药敏纸片到固体平板中，在37℃恒温培养箱内培养18～24h 后观察抑菌圈直径。判定结果为抑菌环直径d＞28mm 为高敏感度，抑菌环直径20mm＜d＜28mm 为中度敏感，抑菌环直径d＜20mm 为耐药。

2 结果与分析

2.1 链球菌的分离鉴定结果

2.1.1 培养特性

分离菌株在普通营养肉汤培养基、链球菌选择性固体平板培养基和兔鲜血琼脂培养基内形成许多单一，半透明边缘的圆形菌落，表面光滑、隆起，大型呈针尖状。挑取单菌落进行革兰氏染色，于光学显微镜下观察，发现菌株为革兰氏阳性链状排列菌。分离菌株在链球菌选择性液体培养基中培养时间过长，肉眼可见试管分层，底部沉淀，上层液体澄清。根据革兰氏染色结果和细菌分离培养结果确定分离到的8 株菌株为疑似链球菌。

2.1.2 生化鉴定结果

如表2 所示，分离到的8 株疑似链球菌的糖发酵试验（乳糖、海藻糖、麦芽糖、甘露醇）均为阳性；七叶苷水解试验6株为阳性，2 株为阴性；马尿酸钠试验6 株为阳性，2 株为阴性；过氧化氢酶试验均为阴性；CAMP 结果显示1 和10 号为阳性，2、3、5、7、8、9、11 和12 号为弱阳性，4 和6 号为阴性。结合细菌培养特性和生化鉴定结果确定检测出3 类链球菌，分别为乳房链球菌（2、3、5、7、8、9、11、12）、无乳链球菌（1、10）和停乳链球菌（4、6）。

表2 分离菌株的生化试验结果

2.2 链球菌的药物敏感性试验

如表3 所示，分离到的8 株乳房链球菌对20 种药敏片的敏感差异度较大，对阿洛西林、氨苄西林、氯霉素、氟苯尼考、红霉素和阿奇霉素的敏感率均超过75%，对万古霉素、诺氟沙星和多西环素的敏感率均超过60%，对头孢唑林、链霉素、新霉素敏感率较低，小于30%。其中酰胺醇类和大环内酯类药物可有效治疗治疗该地区奶牛乳房炎链球菌。

表3 分离菌株的药物敏感试验结果

3 讨论

通过对分离鉴定的8 株乳房链球菌进行20 种药物敏感性试验。发现对-内酰胺类（阿洛西林、氨苄西林）、酰胺醇类（氯霉素、氟苯尼考）、大环内酯类（红霉素、阿奇霉素）药物呈高度敏感，但对头孢唑林、链霉素、新霉素具有不同程度的耐药性，提示之前可能存在使用量过多或滥用现象。刘景喜等（2020）[2]对天津市地区奶牛乳房炎链球菌分离鉴定和耐药性结果发现，乳房链球菌的检出率最高，可达94.74%，这和本试验结果一样，乳房链球菌在奶牛乳房炎链球菌中的感染率最高，需要对乳房链球菌加以防治。王海燕等（2019）[3]对扬州、泰州地区奶牛乳房炎链球菌研究发现，该地区对卡那霉素、庆大霉素、氨苄西林和多黏菌素B 等药物有一定的耐药性。马博等（2020）[4]对新疆石河子地区奶牛乳房炎链球菌研究发现，该地区对链霉素、头孢唑啉、氨苄西林高度敏感，但对青霉素、克林霉素、万古霉素、多西环素具有较好的耐药性，这些结果和本研究有一定出入，可能和不同地区用药情况不同有关。因此，笔者建议在治疗乳房链球菌感染的乳房炎疾病时，需要结合本地区药物敏感试验结果再合理选择抗菌药物进行治疗。