帕金森病小鼠模型自主活动状态下的运动启动分析

王梦月 赵 鑫 曹 枭 王 可 贾 军

(首都医科大学基础医学院生理学与病理生理学学系，北京 100069)

帕金森病(Parkinson’s disease, PD)是一种复杂的神经退行性疾病，其临床症状主要表现为运动迟缓、静止性震颤、肌肉强直、姿势异常等运动障碍[1-2]。临床上对PD患者这些运动症状的评价，多采用帕金森病统一评分量表(Unified Parkinson’s Disease Rating Scale, UPDRS)[3]，而基础研究中对PD动物模型多采用运动行为检测，如旷场行为、转棒实验、爬杆实验及步态分析等[4]。这些指标代表着运动速度和运动幅度的改变，虽能较好地反映PD患者或动物模型的运动能力及运动协调性的变化，但对运动启动障碍的评价却一直缺乏有效、灵敏的指标。

临床研究[5-6]显示，PD患者从站立姿势到开始行走的时间显著慢于正常人，提示PD患者存在运动启动障碍；然而在PD患者的Hoehn-Yahr(H-Y)分级评分量表[7]中，对运动启动障碍依然没有明确的评价标准。在基础研究的动物模型中，对运动启动的研究可划分为两种方式，一种是采用有奖赏或刺激线索的操作式行为模式来评价运动启动[8-10]，但这种模式会影响运动启动评价的准确性；第二种则是在自由活动状态模式下来评价运动启动[11-13]，然而此类模式多集中于对运动启动前或运动启动后的运动改变研究，较少关注运动启动期间的变化[11]。因此，设定客观、标准的运动启动指标，是认识PD运动启动障碍产生机制的重要环节。本研究根据小鼠的运动启动事件，定义出运动启动潜伏期(latency)，比较了自主活动状态下正常小鼠与PD模型小鼠的运动启动差异，为揭示PD运动启动障碍机制提供一种良好的测量指标。

1 材料与方法

1.1 实验动物

C57BL/6小鼠，6～8周，体质量20～22 g，雌雄不限，由北京维通利华实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK(京)2016-0008，饲养于首都医科大学实验动物部实验室。实验动物的使用遵循医学实验动物管理实施细则(1998年卫生部令第55号)以及首都医科大学实验动物管理细则。所有操作得到首都医科大学伦理审查委员会的批准，伦理号：AEEI-2017-062。

1.2 主要药品和试剂

6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine, 6-OHDA, 货号H116-5 MG)、阿扑吗啡(apomorphine, APO, 货号Y0001465)和甘氨酸(货号G8898-500G)，购于美国Sigma-Aldrich公司。酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)抗体(兔源一抗, 货号P40101)购于Pel. Freez公司，红色荧光二抗[驴抗兔IgG (H+L), Alexa Fluor 546, 货号A21206]购于美国Invitrogen公司。

1.3 主要仪器

行为学视频记录系统(Neuromotive系统，美国Blackrock公司)，Noldus动物行为分析系统(Ethovision XT15,荷兰Noldus公司)。

激光共聚焦显微镜(TCS SP8,德国Leica公司)

1.4 实验方法

1.4.1 PD小鼠模型制备

1%(质量分数)戊巴比妥钠(60 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠后，将小鼠固定在立体定位仪上，以前囟为原点定位小鼠内侧前脑束(medial forebrain bundle, MFB),位点囟后1.2 mm, 右侧旁开: 1.2 mm, 深度: 4.75 mm。将3 μg 6-OHDA微量注射于小鼠右侧MFB，制备单侧损伤PD小鼠模型。注射2周后，利用APO诱导的旋转实验进行模型筛选，以对侧旋转净圈数≥5 r/min者判定为成功的PD模型小鼠[14]。

1.4.2 旷场行为学记录

将小鼠放置于白色旷场箱(42 cm×28 cm×20 cm)。暗光条件下利用红外摄像机在旷场正上方记录小鼠的自由活动，采样频率为50 Hz，记录20 min。随后利用Noldus动物行为分析系统分析小鼠运动轨迹，计算小鼠实时运动速度。通过Python自编程序对运动速度进行分析，筛选运动启动事件。

1.4.3 自主活动基础上筛选出小鼠的运动启动事件

通过Python自编程序对运动速度进行分析，筛选运动启动事件。首先，界定出自主活动小鼠的静止状态和运动状态[11, 15]：当小鼠的运动速度小于0.2 cm/s且至少持续2 s以上的时间认为其处于静止状态，当小鼠的运动速度大于2 cm/s且至少持续2 s被认定为其处于运动状态；然后，当小鼠存在从静止到运动的状态转换则认定为一个运动启动事件。在这个过程中，设定即将开始运动启动的时间点(即在静止状态下其运动速度即将超过0.2 cm/s的最后时间点)为运动启动时刻点(motion initiation, MI)；将随后界定为运动状态下其运动速度达到2 cm/s的第一个时间点设为T1，最后将MI到T1的时程定义为运动启动的潜伏期(latency)，这代表着小鼠从静止状态到运动执行状态所需的时间。

1.4.4 免疫荧光染色

完成行为学实验记录后，戊巴比妥钠深度麻醉小鼠，经4%(质量分数)多聚甲醛心脏灌流后取脑，冰冻切片机进行冠状切片，厚度为40 μm。对中脑黑质和纹状体脑片进行TH的免疫荧光染色。脑片在TH抗体(1∶1 000)中4 ℃孵育48 h，驴抗兔荧光第二抗体(546 nm, 1∶500)避光4 ℃孵育过夜。贴片及封片后采用激光共聚焦显微镜拍照。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 PD小鼠模型的建立及检测

按照实验流程(图1A)，在小鼠右侧MFB注射6-OHDA建立单侧损伤PD小鼠模型(model)。造模14 d后，以APO诱导净旋转圈数≥ 5转/min者为PD小鼠模型，相同位点注射等体积0.9%(质量分数)氯化钠注射液(以下简称生理盐水)作为对照组小鼠(sham)。TH免疫荧光染色结果显示，PD小鼠模型损伤侧黑质致密部(substantia nigra pars compacta, SNc)多巴胺(dopamine, DA)能神经元数目及纹状体(striatum, Str)内DA投射纤维均出现了明显丢失(图1B)，表明6-OHDA单侧损伤模型建立成功。采用旷场实验检测小鼠的运动速度，结果表明PD模型组小鼠平均运动速度明显低于正常组小鼠[sham：(6.13 ±0.42) cm/s，n=20；model：(4.58±0.41) cm/s，n=19]，差异有统计学意义(t=2.65，P=0.01)，详见图1C；提示PD小鼠存在着运动障碍。

图1 帕金森病小鼠模型的建立Fig.1 Establishment of Parkinsonian mouse modelsA: timeline for the 6-OHDA injection and behavioral tests; B: confocal photomicrograph examples of coronal brain sections from a 6-OHDA unilaterally lesioned parkinsonian mouse [The white dashed lines indicate the STR (top) and SNc (bottom). The tyrosine hydroxylase (red) shows unilateral loss of dopamine neuron terminals (top) and bodies (bottom)]; C: average velocity of the sham group and the model group; *P<0.05; sham n=20 mice, model n=19 mice; STR: striatum; SNc: substantia nigra pars compacta; 6-OHDA: 6-hydroxydopamine.

2.2 PD小鼠模型运动启动潜伏期

基于运动启动事件的定义，利用Python程序对小鼠运动速度进行数据处理，筛选出正常组小鼠和PD模型组小鼠的运动启动事件，并比较其运动启动的潜伏期。结果显示小鼠运动启动的潜伏期呈偏态离散分布(图2A、B)。PD模型组小鼠运动启动的潜伏期中位数为0.46(1.1)s，对照组为0.90(0.77)s。经非参数检验，两组之间差异无统计学意义(U=311.50，P=0.10)，详见图2C。

图2 运动启动事件的定义以及运动启动潜伏期区间的划分Fig.2 Definition of the motion initiation events and the division of the latencyA: a sample of the motion initiation event(The figure shows the velocity related to MI. The grey shadow indicates the range of the latency.); B: histogram for the motion initiation events frequency and its distribution curve of the sham and the model group; C: latency for the sham and the model group(The black dots show the latencies of individual motion initiation events.); D: proportion of the latency for the sham and the model group in each latency interval; sham n=23 mice, model n=22 mice； MI: motion initiation.

因此，按照0.5 s的bin值进行划分，并统计了全部潜伏期区间内运动启动事件占所有事件的比例(图2D)。结果显示，在PD模型组小鼠中，潜伏期 ≤ 0.5 s的运动启动事件占到了51.61%，高于对照小鼠在此区间内的运动启动事件(18.52%)；而对照组小鼠的运动启动事件多集中在潜伏期 > 0.5 s的范围内(图2D)。因此，结果提示对照组与PD模型组小鼠运动启动潜伏期数据存在着不同的时域分布范围。

2.3 潜伏期对PD模型小鼠运动启动时间的影响

分别对潜伏期≤0.5 s和>0.5 s时限范围内的运动启动事件进行分析，结果显示，潜伏期≤0.5 s时,PD模型小鼠的运动启动较正常对照组小鼠的运动启动潜伏期明显缩短[sham:(0.38±0.04) s，n=23; model：(0.27±0.02) s,n=22]，差异有统计学意义(t=2.27，P=0.03)，详见图3A、B。而潜伏期>0.5 s时，PD模型组小鼠运动启动潜伏期较对照组组小鼠明显延长[sham：(1.16±0.11) s,n=23; model：(1.73±0.23) s,n=22]差异有统计学意义(t=2.07，P<0.05)，详见图3C、D。

图3 两类运动启动事件的运动启动潜伏期Fig.3 The latency for the two types of the motion initiation eventsA: a sample of the motion initiation event when the latency≤0.5 s (The shadow indicates the range of the latency ≤0.5 s.); B: latency for the sham and the model group when the latency ≤0.5 s; C: a sample of the motion initiation event when the latency >0.5 s(The shadow indicates the range of the latency>0.5 s.); D: latency for the sham and the model group when the latency >0.5 s; The black dots show the latencies for the individual motion initiation events; *P<0.05, sham n=23 mice, model n=22 mice.

3 讨论

本研究依据小鼠从静止到运动状态的转换来筛选出运动启动事件，并首次引入了运动启动潜伏期这个新指标，从运动速度和启动时间的二维指标来动态描述小鼠的运动启动过程，客观准确地评价了运动启动的快慢；并基于这样的指标，对PD小鼠模型的运动启动障碍进行了深入分析。结果表明PD模型组小鼠的运动启动潜伏期数据呈现偏态分布，继而划分为潜伏期≤0.5 s和潜伏期>0.5 s两个时限范围进行分析，首次揭示出PD模型小鼠存在着快速多次的运动启动和相对迟缓的运动启动，这为揭示PD的运动启动障碍提供了新的研究思路。

结果显示，在潜伏期≤0.5 s的运动启动时限范围，PD小鼠模型出现了比正常小鼠更快的快速启动。这似乎与PD状态应该是具有较慢的运动启动现象存在着矛盾之处。笔者推测，PD小鼠的这种多次的快速运动启动事件，可能涉及到PD小鼠对准备行为的控制时间不足，进而导致后续运动执行的错误。研究[16]表明人类和动物的行为，始终存在着速度与准确性之间的平衡，需要借助运动控制(motor control)才能全面描述运动。当动作执行的速度越快时，动作的准确性就会降低；这一特点对运动启动来说也同样如此。当PD模型组小鼠出现运动启动过快，这可能就会导致其启动阶段的运动准备控制时间不足，使得后续运动不能有效执行。Howe等[17]和Gritton等[18]新的研究提出胆碱能中间神经元(cholinergic interneurons, CHIs)活动反映的是运动状态的快速转变，而DA的活动则提供产生和维持这种运动状态所需的快速驱动力[19]。在正常运动情况下，DA与CHIs存在着动态的平衡；但在PD中DA减少时，CHIs的活动占主导地位会加剧运动状态的快速转变，导致出现过多过快的运动启动；但由于DA丢失，则会导致这种快速运动启动丧失了继续维持的动力，以及对随后的运动执行也丧失了维持动力。因此，PD小鼠的这种快速启动虽然可以产生，但难以维系并真正达到运动启动以及其后的运动执行，此特点提示快速运动启动对PD运动障碍的效应和机制值得进一步深入关注。

对于潜伏期>0.5 s时限范围的运动启动事件来说，PD模型小鼠产生了明显的运动启动潜伏期延长，由于DA活动具有的促进运动准备的作用[19]以及维持启动后的运动执行的作用[18-19]；当DA减少时，直接导致运动启动需要准备更长的时间，以及后续运动速度和运动执行能力均下降。此外，根据经典的基底神经节频率模型，激活直接途径促进运动，而激活间接途径抑制运动[20]。DA减少导致了两条通路神经元活动不平衡，出现间接通路活动的增加[21]，因此PD模型小鼠可能由于间接通路的过度激活，使得运动启动的潜伏期增长。另外，DA丢失会导致PD动物模型产生一种代偿性的反应，需要牺牲运动速度以保证运动的准确性[16, 22]，导致出现运动速度减慢的特征。在本研究中,PD模型组小鼠不仅在潜伏期>0.5 s时限范围的运动启动事件中存在运动启动迟缓，而且也出现了运动速度降低的结果，符合PD状态下经典的运动启动迟缓现象。

因此本研究首次对小鼠自主活动过程中的运动启动过程进行了新的界定，发现PD模型小鼠存在着不同类型的运动启动障碍，不仅有助于更加全面了解PD运动障碍，更为运动启动的神经机制研究提供可参考的行为学模式。