不同单一酸化剂及复合酸化剂体外抑菌能力比较研究

2021-07-30李瀚林曾凡坤

现代畜牧兽医 2021年7期

雷燕，李瀚林，曾凡坤，孔凌

（1.宜宾学院质量管理与检验检测学部，四川宜宾644000；2.成都大帝汉克生物科技有限公司，四川成都611130；3.英国百沃英生物科技有限公司上海代表处，上海201600；4.西南科技大学，四川绵阳621010）

酸化剂替代抗生素的效果较为稳定，在动物肠道健康中扮演着重要角色[1]。酸化剂在饲料中可以酸化饲料，降低饲料系酸力，改善饲料的适口性，从而提高动物采食量。酸化剂在幼龄动物机体中，可以起到补充胃酸不足，提高饲料的消化利用率，调节肠道微生态平衡等作用[2-4]。目前，市场上主流产品分为以补充胃酸不足的消化酸和以调节肠道微生态平衡的杀菌酸，形式以单一酸和复合酸为主。禁抗背景下，对于酸化剂的评估主要考虑提供氢离子的能力、杀菌能力、适口性等特点。

大肠杆菌（G-）、金色葡萄球菌（G+）是引起畜禽疾病的主要细菌，其流行范围广、发病率高，给畜禽养殖造成巨大的经济损失[5-7]。研究表明，不同的酸化剂可抑制大肠杆菌和金色葡萄球菌的生长[8-10]。酸化剂抑菌作用主要通过2个路径实现：一是在水溶液中通过解离出的H+，降低有害微生物生存环境的pH值，从而抑制有害微生物的生长；另一路径是小分子的有机酸可以透过病原菌细胞壁，进入其细胞内解离出H+，病原菌因极力排除H+消耗ATP耗能而死，同时酸根离子还能干扰细菌DNA和RNA的合成，破坏病原菌细胞膜的完整性，达到抑菌杀菌的作用[1,11-13]。本试验通过菌落法考察不同单一酸化剂以及复合酸在同等酸度的条件下抑菌能力的大小，为酸化剂的选择提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

不同的单一酸化剂及复合酸化剂均由成都大帝生物科技有限公司提供。

无水乙醇（99.8%，分析纯）；0.9%生理盐水；LB肉汤培养基（杭州百思生物科技有限公司；活化菌种）；大肠杆菌、金色葡萄球菌抑菌圈培养基为营养琼脂（杭州百思生物科技有限公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 菌悬液配置

配置LB肉汤，经灭菌后分别接种大肠杆菌、金黄色葡萄球菌，放至好氧培养箱培养18～24 h，用灭菌生理盐水稀释原菌液至10-3，作为试验用菌悬液。对照选用无菌蒸馏水。

1.2.2 样品前处理

酸化剂及复合酸酸度均以5 kg/t乳酸计。样品前处理见表1。

表1 样品前处理Tab.1 Samplepretreatment

1.2.3 涂布菌悬液

按照说明书要求配制选择培养基，稀释原菌液至10-3，用移液枪准确吸取150μL制备好的菌悬液，分别均匀涂布到营养琼脂培养基上。

1.2.4 抑菌试验

分别将不同酸化剂，按照表1设计添加量，准确称取（感量0.001 g）至100 mL无菌容量瓶中，用无菌LB肉汤培养基（热）溶解，待冷却后再用LB肉汤稀释至刻度，然后采用超声50°C助溶30 min，制备成酸化剂溶解液。在无菌条件下，准确移取酸化剂制备溶解液9 mL于灭菌试管中，再用移液枪准确移取1 mL制备好的大肠杆菌、金色葡萄球菌10-3菌悬液接种于盛有9 mL酸化剂溶解液的试管中，混匀盖塞，置于37°C培养箱中培养20～24 h，进行抑菌试验；取出培养好的LB抑菌培养菌悬液，在无菌条件下，用移液管分别准确移取经培养后LB抑菌培养菌悬液1 mL接种于盛有9 mL生理盐水中做10-1稀释，选择10-3稀释倍数菌悬液作为涂布用菌悬液，用移液枪准确吸取150μL制备好的菌悬液于营养琼脂培养基中涂布均匀，置于37°C培养箱中培养20～24 h，取出，观察菌落数。

2 结果与分析

不同酸化剂对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抑菌效果（见表2、表3）

金色葡萄球菌和大肠杆菌平板37℃培养20～24 h后，计数平板菌落数（CFU）。

由表2可知，在同等酸度（以乳酸计）条件下，不同酸化剂对金色葡萄球菌的抑菌强弱顺序为：复合酸化剂＞甲酸＞苯甲酸＞富马酸＞磷酸、乳酸、柠檬酸＞空白。

表2 不同酸化剂对金色葡萄球菌抑菌效果Tab.2 Antibacterial effects of different acidifierson Staphylococcusaureus

由表3可知，在同等酸度（以乳酸计）条件下，不同酸化剂对大肠杆菌的抑菌效果由强到弱的排列顺序为：复合酸化剂＞富马酸＞柠檬酸＞磷酸、苯甲酸、甲酸、乳酸＞空白。

表3 不同酸化剂对大肠杆菌平板菌落数计数Tab.3 Antibacterial effects of different acidifierson E.coli

3 讨论

研究表明，单一酸化剂对于动物的生长性能可以起到促进效果，比如甲酸、柠檬酸以及苯甲酸在断奶仔猪日粮以及育成猪日粮中添加，可以促进生长，提高饲料转化率[14-16]。富马酸可以提高仔猪的回肠消化率，有效促进仔猪平均日增重以及饲料转化率[17-19]。酸化剂促进动物的生长性能与其抑菌杀菌作用密切相关[1,11-13]。本试验中，单一酸化剂对革兰氏阳性菌金色葡萄球菌抑菌能力依次为：甲酸＞苯甲酸＞富马酸＞磷酸、乳酸、柠檬酸；对革兰氏阴性菌大肠杆菌抑菌能力依次为：富马酸＞柠檬酸＞磷酸、苯甲酸、甲酸、乳酸。有研究报道，甲酸、乙酸和丙酸的复合使用可以显著降低家禽肠道内的弯曲杆菌数量[20]，并且复合酸化剂可以有效降低肉鸡肠道中的大肠杆菌数量[21]。本试验研究表明，在同等酸度条件下，复合酸化剂的抑菌能力优于单一酸化剂。在动物体内试验也得到类似结果，在早期断奶仔猪日粮中，添加复合酸化剂的效果优于单一酸化剂[22]。

不同的单一酸化剂，其溶解性及理化性质不同。因此，对不同的病原菌表现出不同的抑菌性能[23]，几种单一酸化剂复配在一起，起到一定的协同作用，可起到协同增效的效果。使用柠檬酸以及山梨酸可以提高断奶仔猪的生长性能，调节肠道代谢[24]；有机酸以及无机酸的混合可以减低大肠杆菌数量，同时提高乳酸菌数量[25]。因此，很多的商业产品使用酸化剂或其盐的组合来实现协同效应。然而，在使用每种酸化剂之前，需要具体考虑其抑制作用及效果[26]，更需要进一步的试验验证。