1,25-(OH)2D3通过lncRNA-uc.412抑制TGF-β1诱导的系膜细胞增殖的机制研究

安梦如，黄 婵，王 锦，王银妃，盛晓静，张爱青，甘卫华，殷 勤

(南京医科大学第二附属医院 儿科，江苏 南京 210003)

慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)是目前社会共同关注的疾病[1]，系膜细胞增殖引起的肾脏纤维化及肾小球硬化是CKD的常见病理改变[2]。大量研究表明，转化生长因子β1(transforming growth factor β1,TGF-β1)在肾脏系膜细胞增殖、纤维化的发生发展中起重要作用[3-4]。1，25二羟基维生素D3[1,25-(OH)2D3]是维生素D的生物活性形式，可通过多种方式保护肾脏，延缓CKD的发生和发展[5]。

长链非编码RNA(lncRNA)是一类以转录长度超过200nt、不编码蛋白为特征的新型RNA分子，lncRNA能够以多种方式在生命有机体的分子信号通路中发挥调控作用[6]。本课题组前期研究发现，lncRNA-uc.412可受TGF-β1调控，在增殖的系膜细胞中表达升高[7]。本研究通过构建TGF-β1处理的大鼠系膜细胞作为增殖模型，探讨1,25-(OH)2D3与lncRNA-uc.412在系膜细胞增殖中的作用及可能的机制，以期为CKD的诊治提供更加精准的靶点。

1 材料与方法

1.1 实验对象 大鼠肾小球系膜细胞株HBZY-1(中国典型培养物保藏中心)。

1.2 主要实验试剂 MTT试剂、1,25-(OH)2D3购于Sigma公司，Trizol试剂购自Invitrogen公司，lncRNA-uc.412慢病毒购自吉凯公司，逆转录试剂盒、PCR试剂盒购于Takara公司，PCR引物由上海锐真生物合成,TGF-β1购于novoprotein公司,SIS3购于MCE公司，DMSO购于Biofroxx公司，细胞周期试剂盒购于US EVERBRIGHT公司。

1.3 实验方法

1.3.1 系膜细胞培养 大鼠肾小球系膜细胞株复苏后用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基(含青霉素100 μL/mL，链霉素100 μL/mL)，在5%CO2、37℃饱和湿度条件下培养，当细胞生长至70%～80%融合时，用0.25%胰蛋白酶消化传代继续培养，细胞传代培养至第3～8代用于实验。收集对数期大鼠系膜细胞，以1×104个/mL接种于96孔板内，每孔200 μL，待细胞贴壁后，无血清DMEM同步化24h后，再进行细胞干预处理48 h并按实验要求分组，用TGF-β1(10 ng/mL)、1,25-(OH)2D3(10-8mol/L)干预分组：正常对照组、TGF-β1组、VD组、TGF-β1+VD组。用smad 3磷酸化特异性抑制剂SIS3(1 μmol/L)与TGF-β1(10 ng/mL)干预分组：正常对照组、TGF-β1组、TGF-β1+SIS3组、SIS3组。

1.3.2 四甲基偶氮唑盐法(MTT)检测各组系膜细胞增殖情况 于各组结束干预前4 h，向每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，继续培养4 h后，去除上清，加入DMSO，室温避光振荡10 min后，使紫色结晶溶解，用酶标仪测定各孔在490 nm波长处的吸光度值(A490)，每组设4个复孔，设置空白调零孔(只加DMEM溶液+MTT+DMSO)，以上实验重复3次，并按下列公式计算各组细胞增殖：细胞增殖率(细胞活力)=(A实验组-A空白对照)/(A阴性对照-A空白对照)×100%。

1.3.3 Real-time PCR法检测目的基因的表达 收集各组细胞，根据RNA提取说明书，Trizol试剂分别提取总RNA，测RNA浓度；参照逆转录试剂盒说明书，配置10 μL逆转录反应体系，制备cDNA；以β-actin作为内参，参照PCR试剂盒说明书进行Real-time PCR。反应体系为20 μL(SYBR 5 μL，上下游引物各0.4 μL，Rox 0.2 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 3 μL)；反应条件为预变性：95℃ 30 s；变性：95℃ 5 s；退火：60℃ 34 s；延伸：60℃ 1 min，40个循环，根据溶解曲线分析扩增产物的特异性，2-△△CT法计算其相对表达量。每个样本设置3个复孔，实验重复3次。所用引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.3.4 流式细胞术检测细胞周期 收集各组细胞，加入75%冰乙醇，吹打均匀，-20℃固定过夜，上机前再次离心，加1 mL冰浴预冷的PBS重悬细胞，配制碘化丙啶染色液，每管加入500 μL碘化丙啶染色液,缓慢并充分重悬细胞沉淀,37℃避光孵育30 min后流式细胞仪检测细胞周期，实验重复3次。

1.3.5 Western blot法检测目的蛋白表达 收集各组细胞，按100∶1加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂，冰上裂解30 min，离心后吸取上层液体用BCA蛋白定量试剂盒测蛋白浓度。每组蛋白上样量为30 μg，经电泳、转模、5%脱脂牛奶封闭，加一抗(浓度1∶1 000)于4℃孵育过夜，TBST漂洗3次，加二抗(浓度1∶5 000)室温孵育1h，TBST漂洗3次后ECL显色，凝胶成像系统进行图像扫描记录。以GAPDH作为内参，用Image J进行灰度值分析，计算目的蛋白的相对表达量。

1.3.6 lncRNA-uc.412过表达慢病毒转染 将处于对数生长期的系膜细胞按1×105/孔接种于6孔板，置于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h后，换用无血清DMEM同步化24 h后，待细胞融合率达60%～70%左右，加入lncRNA-uc.412(2×107TU/mL)过表达病毒液、1,25-(OH)2D3(10-8mol/L)干预分组，继续37℃培养48 h，构建lncRNA-uc.412过表达模型，分为对照组、过表达(uc.412)组与uc.412+VD组。

2 结果

2.1 1,25-(OH)2D3对TGF-β1诱导的系膜细胞增殖率的影响 MTT结果可见，TGF-β1组系膜细胞数量多于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)；与TGF-β1组相比，TGF-β1+VD组细胞数减少，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

与对照组相比，**P<0.01；与TGF-β1组相比，## P<0.01。F=56.020，P<0.001。

2.2 1,25-(OH)2D3对TGF-β1诱导的系膜细胞增殖相关基因及lncRNA-uc.412的表达影响 如图2A～C所示，与对照组比较，TGF-β1组ki67、PCNA mRNA表达量增加，抑制性周期蛋白p27 mRNA表达量下降，差异有统计学意义(P<0.01)；与TGF-β1组比较，TGF-β1+VD组ki67、PCNA mRNA的表达量下降，p27 mRNA表达量增加，差异有统计学意义(P<0.01)。如图2D所示，TGF-β1组的lncRNA-uc.412的表达量较对照组增加，差异有统计学意义(P<0.01)；TGF-β1+VD组的lncRNA-uc.412的表达量较TGF-β1组下降，差异有统计学意义(P<0.01)。

与对照组相比，**P<0.01；与TGF-β1组相比，## P<0.01。FA=9.908，PA=0.001；FB=89.647，PB<0.001；FC=64.911，PC<0.001；FD=88.690，PD<0.001。

2.3 1,25-(OH)2D3对肾小球系膜细胞周期的影响 与对照组比较，TGF-β1组G1期细胞百分率减少，G2、S期细胞百分率增多，差异有统计学意义(P<0.05)；与TGF-β1组相比，TGF-β1+VD组G1期细胞百分率增多，G2、S期细胞百分率减少，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 1,25-(OH)2D3对细胞周期的影响

2.4 SIS3对TGF-β1诱导的系膜细胞lncRNA-uc.412表达的影响 与对照组相比，TGF-β1组的p-smad3蛋白表达升高；与TGF-β1组比较，TGF-β1+SIS3组p-smad3蛋白的表达量下降，差异有统计学意义(P<0.01)(图3A、B)。各组smad3蛋白的表达量差异均无统计学意义(P>0.05)(图3C)。与对照组比较，TGF-β1组lncRNA-uc.412的表达量增加，差异有统计学意义(P<0.01)；与TGF-β1组比较，TGF-β1+SIS3组lncRNA-uc.412的表达量下降，差异有统计学意义(P<0.01)(图3D)。

与对照组相比，**P<0.01；与TGF-β1组相比，## P<0.01。FB=24.030，PB<0.001；FC=3.414，PC=0.053；FD=56.790，PD<0.001。

2.5 1,25-(OH)2D3对系膜细胞lncRNA-uc.412过表达后增殖相关基因的表达影响 与对照组比较，uc.412组ki67、PCNA mRNA的表达量增加，p27 mRNA表达量下降，差异有统计学意义(P<0.01)；与uc.412组比较，uc.412+VD组ki67、PCNA mRNA表达量下降，p27 mRNA表达量增加，差异有统计学意义(P<0.01)。见图4A～C。

与对照组比较，**P<0.01；与TGF-β1组比较，## P<0.01。FA=12.130，PA<0.001；FB=88.190，PB<0.001；FC=15.770，PC<0.001。

3 讨论

肾小球系膜细胞的异常增殖，可引起肾脏纤维化，导致终末期肾病[2,8]。这是许多肾小球疾病的共同特征，其机制尚未完全阐明，临床目前尚无有效治疗方法。因此，亟待从分子和细胞的角度寻找抑制系膜细胞异常增殖的靶点。1,25-(OH)2D3是钙、磷代谢的重要物质，近来发现，1,25-(OH)2D3还可对多种细胞的异常增殖起抑制作用。Mizgalski等[9]发现1,25-(OH)2D3可抑制头颈部鳞状细胞癌的增殖。Jamali等[10]发现，1,25-(OH)2D3是视网膜新生血管形成的有效抑制剂。Zhang等[11]研究表明，1,25-(OH)2D3可抑制EGF诱导的大鼠系膜细胞的增殖。本研究以大鼠肾小球系膜细胞为研究对象，通过TGF-β1干预系膜细胞，成功构建系膜细胞增殖模型，添加1,25-(OH)2D3后发现ki67、PCNA表达下调，p27表达上调，细胞增殖率下降，并将其细胞周期阻滞于G1期。提示1,25-(OH)2D3可抑制TGF-β1所致的大鼠系膜细胞增殖，其机制可能与阻滞细胞周期有关。

lncRNA既往被认为没有生物学作用[12]，但近来发现，lncRNA可通过DNA甲基化、染色质重塑、信使RNA降解等多种方式参与调控各种生命活动[13-14]。在肾脏病学领域，已有多项研究报道相关lncRNA的显著高表达，Ren等[14]报道lncRNA PVT1、lncRNA-PRINS、TapSaki等lncRNAs在急性肾损伤中高表达。Li等[15]发现，lncRNA-NOP14-AS1和lncRNA-HCP5在CKD中特异性高表达。TGF-β1是肾小球系膜细胞异常增生的关键因子[16]，TGF-β1/smad3信号通路参与了系膜细胞的异常增殖及肾小球硬化。本课题组前期在体外TGF-β1诱导系膜细胞增生模型中，发现多个lncRNAs的表达存在差异，其中lncRNA-uc.412的表达水平与系膜细胞增殖程度显著相关[7，17]。本研究用TGF-β1处理大鼠系膜细胞，可观察到细胞增殖率升高，且lncRNA-uc.412的表达量增加，这与我们前期研究结果相符。并且，我们发现过表达lncRNA-uc.412后，ki67、PCNA的表达上调，p27的表达下调，这说明TGF-β1可通过介导lncRNA-uc.412的表达，促进系膜细胞增殖。而1,25-(OH)2D3与TGF-β1共同干预后，lncRNA-uc.412的表达下调；过表达lncRNA-uc.412后，用1,25-(OH)2D3干预发现ki67、PCNA的表达下调，p27的表达上调。这表明，1,25-(OH)2D3可能通过下调lncRNA-uc.412的表达水平抑制TGF-β1诱导的大鼠系膜细胞增殖。

综上所述，1,25-(OH)2D3可抑制TGF-β1诱导的大鼠系膜细胞增殖，其机制可能与1,25-(OH)2D3阻滞细胞周期及下调lncRNA-uc.412的表达有关。但1,25-(OH)2D3是否通过其他途径抑制系膜细胞增殖，lncRNA-uc.412调控系膜细胞增殖的深层机制，还有待于进一步研究。