基于网络药理学探讨三七治疗骨关节炎的有效活性成分及潜在作用机制

赖燕清

（福建医科大学附属龙岩第一医院 龙岩364000）

骨性关节炎（Osteoarthritiis,OA）是临床中最常见的一种骨退行性病变，临床多表现为关节疼痛、肿胀以及活动受限[1～3]。流行病学研究结果显示，全球范围内约有1.4亿人患有OA[4]。目前OA治疗并无靶向性药物，早中期多使用非甾体类药物干预，但存在明显的胃肠道副反应，因此只适合短期对症治疗[5～6]。中医药对于早中期OA有着良好的疗效，在OA的治疗中日益受到认可[7]。三七是一味临床上常见治疗OA的中药，具有祛风除湿、通痹止痛的功效[8～9]。现代药理学研究显示，三七具有抗炎、镇痛以及抗肿瘤等作用[10～11]。但三七对OA的作用机制，目前尚不明确。网络药理学可以利用现有文献基础和生物信息学，从多成分、多靶点以及多通路的角度出发，构建“药物-成分-靶点-疾病”网络，探讨多种中药成分与疾病之间的相互作用机制。因此本研究拟运用网络药理学技术，初步探讨三七配伍对OA的作用机制，以期为后续研究提供理论参考。现报道如下：

1 工具与方法

1.1 三七活血成分及潜在治疗靶点收集 使用中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP）数据库[12]对三七的活性成分进行筛选。以利用度（OB）≥30%以及类药性（DL）≥0.18为条件进行筛选，并将筛选后的活性成分使用TCMSP、草药成分指标数据库（Herbal Ingredients'Targets Database,HIT）[13]及PubChem数据库查找相应靶点，并使用Excel进行整理。

1.2 OA治疗靶点收集 使用治疗靶点数据库（Therapeutic Target Database,TTD）[14]以 及GeneCards数据库[15]收集OA潜在治疗靶点，以“Osteoarthritis”为检索词，采用Excel将得到的靶点信息进行整合。TTD数据库即含有研究成功的临床药物靶点，也有目前在研的药物靶点，且均经过试验验证，可信度较强。GeneCards通过整合网络多个基因数据库，含有所有关于人类的基因注释信息和预测信息，信息较全。

1.3 构建“药物-成分-靶点-疾病”网络 将三七有效活性成分相应靶点以及OA治疗靶点进行合并，取其交集，即为三七-OA潜在治疗靶点。以三七有效成分和三七-OA潜在治疗靶点为节点，在Excel表格中建立药物-成分-靶点-疾病关系，导入Cytoscape3.7.2软件中建立三七活性成分与OA治疗靶点之间的相互作用网络。

1.4 KEGG通路以及GO富集分析 将三七-OA潜在治疗靶点在David网站[16]进行KEGG（京都基因与基因组百科全书）通路富集分析以及基因本体（Gene Ontology,GO）生物过程富集分析，GO分析包括生物学过程（Biological Process,BP）、细胞组分（Cellular Component,CC）、分子功能（Molecular Function,MF）三个部分。使用R语言对P值进行校正并选择前10个分析结果进行气泡图展示，进一步探讨三七治疗OA的潜在作用机制。

1.5 关键基因鉴定以及子模块分析 使用STRING数据库[17]对三七-OA治疗靶点构建蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPI），随后使用Cytoscape软件进行可视化。具有最高自由度的基因被认为是关键基因。对三七-OA共靶向基因进行模块分析，使用MCODE插件进行子模块分析，子模块纳入标准如下：MCODE评分＞5，节点数量＞10，并对模块分析结果进行KEGG通路富集分析。

2 结果

2.1 三七活血成分及潜在治疗靶点 在TCMSP数据库中，以口服OB≥30%以及DL≥0.18为筛选条件，检索到8种三七有效成分，其中包括β-谷甾醇、豆甾醇、槲皮素以及人参皂苷等。见表1。将检索到的有效成分在TCMSP及HIT数据库上收集相应的治疗靶点，Excel整理查重后共有186个治疗靶点。

表1 TCMSP数据库中三七有效成分

2.2 三七治疗骨关节炎靶点 通过检索TTD以及GeneCards数据库，Excel整理取出重复值，共筛选出骨关节炎潜在治疗靶点1 282个。将三七治疗靶点与骨关节炎治疗靶点进行匹对，共发现靶点88个。见图1。

图1 三七治疗OA靶点

2.3 “药物-成分-靶点-疾病”网络 将三七的每个有效成分和其相对应治疗靶标导入Cytoscape软件中，绘制成分-靶点对应图形，以红色倒三角形代表三七活性成分，黄色圆形代表潜在治疗靶点。结果显示三七中主要活性成分包括β-谷甾醇、豆甾醇、人参皂苷Rh2、食脂素、亚油酸乙酯以及槲皮素，而其中最主要的三个活性成分为β-谷甾醇、人参皂苷Rh2以及槲皮素。见图2。

图2 “三七-成分-靶点-疾病”网络图

2.4 KEGG通路富集分析 将关键靶基因在David网站中进行KEGG通路富集，共富集显著性通路101条。使用R语言对P值进行校正并选择前10条通路进行气泡图展示。结果显示三七治疗OA的信号通路主要富集在肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、Toll样受体信号通路、凋亡以及缺氧诱导因子-1（HIF-1）信号通路等。见图3。

图3 三七-OA共同靶点KEGG通路富集分析结果

2.5 GO富集分析 将获得的三七-OA共同靶点放入David网站上进行GO富集分析，选择生物学过程（BP）、分子功能（MF）以及细胞组分（CC）三个内容。结果显示三七-OA共同靶点在BP上主要富集在药物反应、衰老、缺氧反应以及炎症反应等生物学过程上；在MF上主要富集在酶结合、转录因子结合、蛋白结合以及细胞因子活性等分子功能上；在CC上主要位于细胞外间隙、胞膜以及细胞质中。见图4～图6。

图4 三七-OA共同靶点GO-BP富集分析结果

图5 三七-OA共同靶点GO-MF富集分析结果

图6 三七-OA共同靶点GO-CC富集分析结果

2.6 关键基因以及子模块分析 三七-OA共同靶点蛋白-蛋白互作网络如图7所示，自由度前3个基因分别为IL-6、TNF以及AKT1，被认为是关键基因。MCODE插件发现子模块1个，含有45个节点、780条边，如图8A所示。使用David数据库对子模块进行KEGG分析，子模块基因主要富集在TNF信号通路以及类风湿性关节炎等。见图8B。

图7 三七-OA共同靶点蛋白-蛋白互作网络

图8 子模块分析以及KEGG通路富集分析结果

3 讨论

随着我国老龄化社会程度加重，我国OA患者呈逐年增加趋势。OA的主要病理表现有滑膜炎症、软骨损伤以及软骨下骨的反应性增生[18]。流行病学调查结果显示，OA是导致下肢残疾的十大原因之一[19]。关节置换术被认为是治疗终末期OA的黄金方法，但其仍然存在疗效不满意、并发症高、感染、返修等不足[20]。因此如何延缓早中期OA患者过早进展成重度OA，延缓初次关节置换年龄一直是骨科医师研究的重点。

中医药在早中期OA治疗中的疗效一直受到认可[7,21]。OA属于中医学痹病范畴，多由于素体正气不足，腠理不密，卫外不固，外邪入侵可使津血运行不畅，气滞血瘀，不通则痛；此外长期反复发作可进一步损伤肝肾，导致肝肾亏虚，筋脉失养，不荣则痛。三七有化瘀止血、活血定痛功效，对于早中期OA患者，可以有效促进血液运行，避免气滞血瘀，延缓早中期OA患者过早进展成重度OA。户红卿等[9]的研究结果显示，三七结合针灸可以有效改善血瘀型膝原发性骨关节炎患者临床症状；乔登朝等[22]的研究结果也显示三七可以有效抑制创伤性膝关节滑膜炎，抑制患者疼痛。现代药理学研究结果也显示三七总皂苷可以有效抑制关节炎大鼠血清中炎症介质的表达，从而达到抑制滑膜炎、改善患肢功能的疗效[10]。此外，三七总皂苷联合白芍总苷具有抑制急性痛风性关节炎大鼠血清中IL-1β、IL-18、TNF-α含量，并抑制滑膜组织中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-18、TNF-α等表达的作用[23]，然而三七对于OA的作用机制，目前尚不明确。

本研究从网络药理学出发，探讨三七治疗OA的潜在治疗机制。本研究共检索出三七8种有效治疗成分，映射治疗OA靶标88个。在“药物-成分-靶点-疾病”网络中发现有3种有效成分最为显著，即β-谷甾醇、人参皂苷Rh2以及槲皮素。GO富集结果显示三七-OA共同靶点主要富集在药物反应、衰老、缺氧反应以及炎症反应等生物学过程上，提示三七可以有效抑制OA炎症，这与之前的文献结果也是相符的[10，23]。KEGG通路富集结果显示三七治疗OA的信号通路主要富集在TNF信号通路、Toll样受体信号通路、凋亡以及HIF-1信号通路等。TNF信号通路、Toll样受体信号通路与炎症、免疫调节等生物学功能密切相关，进一步提示三七对于OA炎症的抑制作用。此外，PPI网络显示三七治疗OA的前3个关键基因为IL-6、TNF以及AKT1，且子模块KEGG通路富集分析结果也显示主要富集在TNF信号通路上，提示三七治疗OA可能与TNF炎症信号通路相关。

综上所述，本研究以经典中药三七为研究对象，利用网络药理学和生物信息学相关技术，探讨三七治疗OA的有效活性成分、潜在靶点以及相关信号通路，构建药物成分靶点网络并进行KEGG和GO富集分析，阐述三七治疗OA的潜在作用机制。结果显示三七治疗OA最主要的三个活性成分为β-谷甾醇、人参皂苷Rh2以及槲皮素；三七治疗OA主要涉及炎症反应、衰老、缺氧等生物学过程；三七治疗OA主要通过肿瘤坏死因子信号通路、衰老以及Toll样受体相关通路等；三七治疗OA前3位关键基因为IL-6、TNF、AKT1。