迷迭香酸对PM2.5诱发变应性鼻炎氧化应激反应的防护作用△

周玲玲 韩之瑾 章如新 王晋超 黄昱 孙娜 胡嘉桦 鲍婧 董维阳 邓从蕊 庄国顺

(1.复旦大学附属华东医院耳鼻咽喉科 上海 200040；2.复旦大学环境科学及工程系 上海 200433)

变应性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是鼻科领域的常见病，严重影响人类健康[1]。AR不仅受遗传因素的影响，还与环境因素尤其是大气污染密切相关[2-3]。有研究[4]发现，空气中的细颗粒物(particulate matter 2.5，PM2.5)，空气动力学直径≤2.5 μm的大气污染物，可引起鼻黏膜上皮细胞氧化应激反应、鼻黏膜上皮屏障损害等。迷迭香酸(rosmarinic acid，RA)是一种天然存在的酚酸类化合物，可作为抗氧化剂减轻氧化应激反应[5]，还具有免疫调节功能[6]，并对鼠类哮喘模型的气道炎症和高反应性有抑制作用[7]。但目前尚无AR针对PM2.5暴露AR抗氧化应激作用的研究。本研究将通过观察RA对AR大鼠模型PM2.5暴露后鼻黏膜上皮细胞氧化应激反应，为PM2.5诱发加重AR的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 PM2.5的采集 研究使用的PM2.5是从上海市区内PM2.5检测站安置专用采集器收集的。采集器采用Whatman 41滤膜(Whatman,英国)和TSP / PM10 / PM2.5-2采样器(Dickel,中国)，收集后置于恒温恒湿箱中，在温度(20.0±0.1)℃、相对湿度(40±2)%实验条件下，电子天平(Sartorius 25S BT，精密度为10 μg，德国)对经过平衡48 h以上的样品进行称量。将PM2.5样品超声振荡洗脱45 min，收集洗脱液，过滤。在-20 ℃冰箱保存PM2.5样品备用。

1.2 实验分组和AR大鼠模型制备 选取5周龄清洁级雌性Sprague-Dawley大鼠32只，体重180~200 g。所有实验步骤符合复旦大学动物伦理委员会的要求(编号：SYXK-2014-0029-DF358)。大鼠适应性饲养1周，称重并编号，随机分为4组：正常对照组(NC组)，AR模型组(AR 组)，PM2.5吸入暴露AR模型组(ARE组), RA干预PM2.5吸入暴露AR模型组(RA组)。按Guo等[8]报道的卵清蛋白(ovalbumin, OVA)致敏法制备AR动物模型。将抗原OVA(Sigma-Aldrich公司,美国)30 mg、佐剂氢氧化铝(Sigma-Aldrich公司,美国)3 000 mg和生理盐水100 mL配成混悬液，每次致敏使用1 mL。隔天腹腔内注射1次，共7次(第1、3、5、7、9、11、13天)。同期在NC组腹腔注射相同体积的无菌盐水。间隔10 d，从第24~30天，每天1次在鼻腔内以1%OVA100 μL滴鼻，连续7 d，进行鼻腔局部激发。在相同条件下，对NC组大鼠使用无菌盐水滴注。按照以上步骤对AR组、ARE组和RA组进行AR造模。RA组从第24~30天，以20 mg/kg计算，每天腹腔注射RA 4 mg(Meilunbio公司，大连)进行干预，共7 d。

1.3 PM2.5吸入暴露方法 本研究采用浓度可调控PM2.5吸入暴露装置。装置由PM2.5密封透明暴露观察舱、PM2.5气溶胶生成系统、PM2.5监测系统、空气输入输出系统及PM2.5过滤系统等组成。将PM2.5和加压后的空气一起放入PM2.5气溶胶生成系统，通过调节输出PM2.5气溶胶速度，PM2.5监测系统实时测定暴露舱内PM2.5浓度，使PM2.5浓度稳定维持在1 000 μg/m3。 ARE组和RA组从基础致敏开始连续30 d吸入浓度1 000 μg/m3PM2.5，每天3 h。而NC组和AR组以无菌生理盐水吸入暴露。

1.4 大鼠鼻部生物学行为观察 记录不同组别大鼠第30天最后1次鼻腔局部激发后15 min内生物学行为：喷嚏及挠鼻次数，评估大鼠鼻部症状。

1.5 大鼠标本采集 大鼠鼻部生物学症状评估后，按3%戊巴比妥钠进行腹腔注射(30 mg/kg)，待完全麻醉后，解剖腹腔暴露腹主动脉取血，收集血液，3 000×g离心10 min提取血清，-80 ℃保存待检。解剖鼻腔并取鼻中隔其中一侧鼻黏膜置于4%甲醛溶液固定，收集鼻腔黏膜新鲜组织标本送检测。

1.6 大鼠样本检测 生化法测定大鼠鼻黏膜超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性和丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量；酶联免疫吸附测 定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测血清OVA特异性IgE(ovalbumin-specif ic IgE，OVA-sIgE)；免疫荧光法检测鼻黏膜上皮细胞中核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor-2，Nrf2)表达量；苏木精-伊红(hematoxylin eosin，HE)染色观察大鼠鼻黏膜的病理学改变。

1.7 统计学处理 本研究使用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计学分析，数据以(?)表示，组间差异采用单因素方差分析。使用Image Pro Plus 6.0图像进行半定量分析。以P<0.05作为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠生物学行为评估 对各组大鼠进行生物学行为观察，AR组、ARE组大鼠的喷嚏及挠鼻次数显著高于NC组(P<0.01)，而RA组大鼠喷嚏及挠鼻次数低于ARE组(P<0.01)，见图1A和图1B。ELISA测定各组大鼠血清OVA-sIgE含量：NC组、AR组、ARE组、RA组OVA-sIgE分 别 为(5.32±0.97)、(115.17±11.83)、(145.04±9.54)、(113.73± 13.71)ng/mL，AR组大鼠OVA-sIgE显著高于NC组(P<0.01)，ARE组较AR组增加(P<0.01)，RA组较ARE组下降(P<0.01)，见图1C。

图1 RA对PM2.5暴露AR大鼠鼻部症状及血清OVA-sIgE的影响 A.大鼠喷嚏次数；B.大鼠挠鼻次数；C.大鼠血清OVAsIgE。*示P<0.05，**示P<0.01，***示P<0.001。

2.2 RA对PM2.5暴露AR大鼠鼻黏膜上皮细胞氧化应激的影响 采用生化法测定鼻黏膜匀浆中SOD活性和MDA含量，见图2。NC组、AR组、ARE组、RA组的SOD活性分别为(135.67±4.33)、(81.01±9.32)、(25.50±12.84)、(127.92±15.34)U/mg。SOD水平自NC组、AR组到ARE组，呈逐渐降低趋势，RA组SOD活性较ARE组增加(P值均<0.01)，见图2A。NC组、AR组、ARE组、RA组的MDA含量分别为(29.69±4.21)、(51.34±5.23)、(73.13±3.14)、(50.19±2.99)nmoL/mg。MDA水平自NC组、AR组到ARE组，呈逐渐增加趋势，而经过RA处理后MDA较ARE组下降，以上差异均有统计学意义(P值均<0.01)，见图2B。

图2 RA对PM2.5暴露AR大鼠鼻黏膜SOD和MDA的影响 A.大鼠鼻黏膜SOD活性；B.大鼠鼻黏膜MDA含量。*示P< 0.05，**示P < 0.01，***示P<0.001。

各组大鼠鼻黏膜细胞Nrf2蛋白免疫荧光染色和半定量分析显示见图3。图中绿色表示鼻黏膜上皮细胞核中Nrf2蛋白含量。NC组、AR组、ARE组和RA组分别为0.11±0.02、0.15±0.03、0.21±0.02、0.15±0.03。相对于NC组，AR组Nrf2蛋白表达升高(P<0.01)，ARE组较AR组表达升高(P<0.01)，RA组较ARE组表达下调(P<0.01)。

图3 RA对PM2.5暴露AR大鼠鼻黏膜Nrf2表达的影响 A.NC组(×200)；B.AR组(×200)；C. ARE组(×200)；D. RA组(×200)；E. Nrf2半定量结果。*示P<0.05，**示P<0.01，***示P<0.001。图中绿色荧光代表细胞核中Nrf2蛋白表达。

2.3 RA对PM2.5暴露AR大鼠鼻黏膜组织病理学的影响 HE染色结果显示，NC组大鼠鼻黏膜组织结构整齐(图4A)，而AR组大鼠鼻黏膜上皮细胞排列略显紊乱，腺体扩张，间质细胞增多，血管扩张(图4B)。ARE组大鼠鼻黏膜上皮细胞脱落，黏膜固有层炎性细胞浸润明显增多及腺体增生，血管扩张(图4C)。RA干预后大鼠鼻黏膜病理损伤减轻(图4D)。

图4 RA对PM2.5暴露AR大鼠鼻黏膜组织病理学的影响(×400) A.NC组；B.AR组；C.ARE组；D.RA组。

3 讨论

AR是鼻部Ⅰ型变态反应性疾病，由于发病机制复杂，其病因尚未完全被揭示[9]。AR的防治仍然是目前面临的一个重要课题。近年来大气污染诱发AR日益引起关注。PM2.5对AR的发病影响已被流行病学资料所证实。

鼻腔作为呼吸防御系统的第一道门户，首当其冲会受到PM2.5有害物质的刺激，从而诱发AR，增加了相关医疗费用支出[10]。Tacer等[11]在PM2.5高暴露区研究发现PM2.5浓度每增加10 μg/m3，儿童AR患病率增加1.15倍。国内研究通过对229 685名北京市民AR日门诊量和当日PM2.5浓度相关联，发现PM2.5含量每增加10 μg/m3，当天AR门诊人次增加0.47%[12]。所以PM2.5暴露下AR的防治尤 为重要。

AR为IgE介导的变态反应性疾病，当机体受到过敏原刺激后，浆细胞产生的IgE抗体，与肥大细胞表面Fc-εRI受体及变应原发生交联反应，促使肥大细胞脱颗粒释放白三烯、肝素等炎性介质，促发AR相应临床症状。在本研究中，血清OVA-sIgE水平自NC组、AR组到ARE组呈逐渐增高趋势，与大鼠的鼻部症状喷嚏、挠鼻一致。表明AR动物模型制备成功，PM2.5吸入暴露后可进一步加重鼻黏膜的免疫应答。经过RA干预后，PM2.5暴露AR大鼠的鼻部症状改善，血清OVA-sIgE减少。RA可以通过减少OVA-sIgE改善PM2.5暴露AR大鼠的鼻部症状，减轻变态反应。

当抗氧化系统无法消除多余活性氧(reactive oxygen species，ROS)时，抗氧化系统和氧化系统的平衡被破坏，可引发氧化应激，而氧化应激反应参与AR发病过程。SOD是重要的抗氧化酶，催化超氧阴离子自由基歧化生成氧和过氧化氢[13]。MDA是机体内自由基作用于脂质发生过氧化反应的最终氧化产物，具有细胞毒性作用，间接地反映出细胞损伤的程度[14]。Nrf2是细胞内抗氧化应激相关转录因子，主要表达在细胞质中。当细胞处于氧化应激，Nrf2活化从胞质转运入核[15]。本研究发现经过OVA致敏后AR大鼠鼻黏膜中的SOD活性降低，而MDA含量增加，鼻黏膜中的Nrf2表达增加。PM2.5是空气污染的重要污染物，其毒性效应来自PM2.5含碳核心及其包含的有机成分如多环芳烃类化合物和无机成分如金属离子。有文献[16]报道PM2.5暴露加重AR患者的氧化应激反应。我们前期研究发现PM2.5可以通过氧化应激反应、线粒体离子稳态失衡和线粒体损伤机制导致鼻黏膜损伤[17]。本研究发现AR大鼠持续吸入暴露PM2.5后，鼻黏膜上皮细胞脱落坏死，腺体增加，间质细胞增多。大鼠鼻黏膜中SOD活性降低而MDA含量增加。鼻黏膜细胞核中Nrf2荧光表达增加。PM2.5 通过氧化应激反应引起鼻黏膜炎性反应从而改变鼻黏膜上皮细胞形态，降低细胞活性，引起鼻黏膜上皮细胞损害及屏障功能障碍，诱发及加重AR。

RA广泛存在植物中，常见于迷迭香和紫苏等，其分子式为C18H16O8，相对分子质量为360.33，具有很强的抗氧化性[18]。有文献[19]报道RA可以通过清除紫外线诱导的细胞内ROS，对中波紫外线诱导的HaCaT细胞形成氧化应激保护作用。Rong等[20]发现RA可以通过激活Nrf2诱导的细胞抗氧化防御系统来减轻淀粉样β蛋白诱导的氧化应激。RA在小鼠哮喘模型中可以显著升高SOD的低水平表达，明显抑制ROS的高水平表达，上调抗氧化因子Cu/Zn SOD蛋白，下调NOX-2和NOX-4 mRNA蛋白表达，来减轻肺损伤[21]。RA作为天然存在的抗氧化剂，副作用小，受到广泛关注。本研究发现，经过RA干预的PM2.5暴露AR模型，鼻黏膜上皮细胞纤毛脱落减少，黏膜下间质细胞减少，组织肿胀减轻；大鼠鼻黏膜内SOD活性升高，MDA含量降低；鼻黏膜细胞内Nrf2蛋白表达减少；鼻黏膜损伤减轻。RA可能通过降低Nrf2转录因子表达，增加SOD活性和降低MDA含量，改善PM2.5暴露引起的氧化还原反应，减轻鼻黏膜的损伤。

RA可以通过调节氧化应激反应缓解PM2.5暴露AR大鼠的鼻部症状及鼻黏膜损伤，作为抗氧化剂在PM2.5诱发AR的防治中具有潜在的应用前景。