脲酶/硝化抑制剂减少农田土壤氮素损失的作用特征

2021-07-30宋涛尹俊慧胡兆平王亮亮张强陈清曹文超

农业资源与环境学报 2021年4期

宋涛，尹俊慧，胡兆平，王亮亮，张强，陈清，曹文超，3*

（1.养分资源高效开发与综合利用国家重点实验室，金正大生态工程集团股份有限公司，山东临沭 276700；2.中国农业大学资源与环境学院，北京 100193；3.海南省热带生态循环农业重点实验室，中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海口 571101）

在农业生产过程中，氮肥的必要投入是保证作物产量并满足人口增长需求的关键[1]。然而，农户为了追求农田作物的高产稳产，盲目和过量施用氮肥，导致氮肥利用率降低。据报道，约有50%的肥料氮并未被作物吸收利用，主要以氨（NH3）挥发、硝化和反硝化作用等过程释放出的各种气体[包括氧化亚氮（N2O）]以及硝酸盐淋洗等形式排放至大气、深层土壤或水体环境中[2]。这不仅增加了农户的经济效益损失，也对大气、水环境以及人类健康构成潜在威胁[3]。例如，NH3是空气雾霾或灰霾的主要贡献者[4]。与NH3挥发相比，N2O 排放量较低，但它是破坏大气臭氧层的主要因子，也是重要的温室气体之一[5]。最新研究显示，全球N2O 排放的增长速度快于联合国政府间气候变化专门委员会（IPCC）的预测，这将使全球气候变化风险加剧[6]。此外，由于其本身带负电荷，易于淋洗至地表水和地下水，造成水体富营养化和地下水污染[7]。因此，如何减少氮素损失、提高氮肥利用率并降低氮素损失对环境的负面影响已引起人们广泛关注。

近年来，除与作物生长相匹配的精细施肥和农田管理措施外，脲酶/硝化抑制剂的利用也是有效阻控农田土壤氮素损失的重要手段。脲酶/硝化抑制剂分别通过抑制土壤脲酶和氨氧化微生物的活性来延缓相应的氮素转化过程，因其具有明显提高氮肥利用率并减少氮素损失的作用，越来越受到人们的重视[8]。Zaman 等[9]研究表明，脲酶/硝化抑制剂与化肥或有机肥配合施用有利于增加氮肥利用率、提高作物产量，并可降低由大量施用氮肥引发的环境风险[8]。然而，在不同土壤环境条件下，脲酶/硝化抑制剂的有效性差异较大，目前对其在农田土壤中的作用效果和影响因素仍缺乏系统性研究。

因此，本文以典型脲酶抑制剂N-丁基硫代磷酰三胺（NBPT）和硝化抑制剂3，4-二甲基吡唑磷酸盐（DMPP）和双氰胺（DCD）为例，重点阐明相关抑制剂的作用特征及其对土壤NH3挥发、N2O 排放淋洗和作物产量的影响效果及影响因素，以期为脲酶/硝化抑制剂在农业中合理应用和推广提供科学的指导。

1 脲酶抑制剂

1.1 作用机理

尿素在全球合成氮肥市场中占比约55%，是农业生产上最常用的氮肥类型[10]。尿素施入土壤1～2 d内在土壤脲酶的催化作用下迅速水解为碳酸铵[11]，随后分解为CO2和铵态氮[12]。土壤脲酶是一类含镍的金属钛酶，其活性位点包含由氨基甲酸酯桥连在一起的两个镍原子。如图1[13-14]所示，脲酶抑制剂（Urease inhibitor）通过抑制土壤脲酶活性来减缓尿素向-N转化[15]。脲酶抑制剂种类主要包括：①与脲酶巯基基团反应的有机或无机化合物，如氢醌、对苯醌等；②与脲酶活性位点中的镍原子形成络合物的金属螯合物，如乙酰羟肟酸、乙酰氧肟酸；③与脲酶活性位点相结合，不易被脲酶水解的竞争性抑制剂，如NBPT[16]。NBPT 是目前研究最多且使用最广泛的脲酶抑制剂[17-18]。NBPT 并不直接抑制脲酶活性，而是在有氧条件下先迅速转化为它的氧化产物NBPTo，随后再与脲酶活性位点形成三齿键[19]，进而减缓尿素被脲酶水解的速率[13，20]。由于NBPTo 本身降解较快，通常直接使用NBPT 更能相对持久地延缓尿素水解[21]。此外，近年来有研究发现，土壤中施入NBPT 后氨氧化细菌（AOB）和氨氧化古菌（AOA）的氨单加氧酶基因（amoA）拷贝数也显著降低，原因可能是NBPT 具有抑制氨氧化菌细胞内脲酶活性的能力，因而减少了胞内硝化作用底物NH3的有效性，并进一步推测NBPT能够抑制胞内氨氧化菌的硝化作用[22]，但也有研究认为，NBPT对氨氧化菌丰度和种群结构均无影响[23]。

图1 土壤脲酶/硝化抑制剂的作用机制[13-14]Figure 1 Inhibitory mechanism of urease and nitrifications in soils[13-14]

1.2 环境和农学效应

1.2.1 对NH3挥发的影响

土壤NH3挥发是农田氮素气态损失的重要途径之一，对大气颗粒物PM10和PM2.5的形成具有重要贡献[24]。化学氮肥的施用是农田土壤NH3挥发最为重要的来源。据报道，施用到土壤表面的尿素中约有25%转化为NH3并挥发到大气中[25]，而在高温和潮湿的环境条件下，土壤施用尿素后NH3挥发损失甚至高达40%[26]。

脲酶抑制剂与尿素配合施用能够降低土壤NH3日挥发量，并减少NH3损失总量[16-17]。Silva 等[16]通过大样本分析发现，NH3在尿素和尿素+NBPT 处理中挥发损失比例分别为施氮量的31.0%和14.8%，施用脲酶抑制剂可使氨挥发损失量减少52%。Cantarella等[27]研究发现，与单施尿素处理相比，增施NBPT显著降低土壤NH3损失量达53%。在稻田土壤中，添加NBPT 后NH3挥发峰值降低27.0%，累积NH3挥发损失量降低21.7%[28]。室内试验也表明，与单施尿素处理相比，配施NBPT 降低了54%～78%的NH3挥发损失量[29]。脲酶抑制剂还能减缓尿素水解速率，如尿素和尿素+NBPT 处理NH3挥发总量达一半时所用的时间分别为4.8 d 和8.3 d[26]。此外，NBPT 也可减少有机肥中的NH3损失。如Li等[30]发现，在有机肥中添加NBPT后，土壤NH3挥发量由施氮量的15%降为8%。

NBPT 抑制土壤NH3的作用效果受土壤pH、灌溉和降水等因素影响。pH 调控土壤溶液中NH3与的浓度（aq）⇄H+（aq）+NH3（aq）⇄NH3（g）]，是影响土壤NH3挥发的重要因素[31]。在中性或碱性条件（pH>7），易形成NH3并产生挥发损失，而在酸性条件下，大部分NH3转化为离子态[32]，降低了氨挥发的风险。与低pH 土壤相比，在高pH 土壤中施用尿素后NH3挥发潜势较高[33]。Engel 等[20]对pH 为8.2 的沙壤土进行培养（20 ℃）发现，尿素和尿素+NBPT 分别在5 d和18 d 后完全水解。同时，由于NBPT 在酸性土壤中降解快于碱性土壤，因而pH 也会影响脲酶抑制剂在土壤中的抑制效果[34]。如在pH 5.6 和pH 6.4 的土壤中，添加NBPT 后NH3挥发损失比例减少52%～53%，而在pH 为4.5 的极酸性土壤中，NBPT 减少NH3损失的比例仅为18%[35]。此外，Holcomb 等[36]发现在砂质壤土中，增加灌溉量可显著降低NH3损失。大量降雨或灌溉能够降低土壤NH3挥发损失，甚至使NBPT 无法产生抑制效应。

1.2.2 对温室气体N2O排放的影响

N2O 作为对流层重要的温室气体之一[37]是破坏平流层臭氧层的主要因子[38]，对全球气候和环境变化具有重要影响。与NH3挥发量相比，N2O 排放量占施氮量的比例通常较低，平均值在1%左右[39-40]。化学氮肥的施用增加农田土壤N2O 排放[41]，且有研究认为硝化作用过程是我国北方石灰性土壤N2O 产生的主导途径[42-43]。脲酶抑制剂在减少NH3挥发的同时，也会影响硝化作用及后续反硝化作用速率[9]。因此，脲酶抑制剂配施尿素可能是降低N2O 排放的重要措施之一（表1）。Ding等[44]对华北平原农田土壤玉米种植季的研究表明，与单施尿素相比，增施NBPT 可减少37.7%的N2O 排放。Dawar 等[45]在牧场土壤中发现，NBPT 与尿素配施后能够显著降低N2O 排放。Martins等[46]在热带土壤中发现，NBPT 能够通过抑制NH3挥发来减少N2O 的间接排放。Zhao 等[47]对石灰性土壤小麦-玉米轮作体系连续3 年的田间监测结果显示，与单施尿素相比，尿素配施NBPT 在玉米、小麦生长季和全年均显著降低了N2O 排放。这可能主要与脲酶抑制剂NBPT 延缓尿素水解、降低土壤浓度有关；另一方面，作物氮肥利用率的提高也会降低硝化和反硝化作用底物和浓度，进而减少N2O排放。

表1 脲酶抑制剂对土壤N2O排放的影响Table 1 Influences of urease inhibitors on soil N2O emissions

Fan等[48]基于荟萃分析发现，土壤pH是影响NBPT降低N2O 排放的关键因素，NBPT 在碱性土壤中显著降低了N2O 排放，而在酸性土壤中则无明显影响。多数情况下尿素添加脲酶抑制剂后土壤N2O 排放降低或差异不显著[49]，但也有研究发现添加脲酶抑制剂后增加了N2O的排放[37]。这可能是由于土壤初始含量和含水量较高，易于反硝化作用过程进行，尿素水解并未直接影响N2O排放。

1.2.3 对硝酸盐淋洗的影响

1.2.4 对作物氮肥利用率和产量的影响

脲酶抑制剂在降低氮素损失的同时，也一定程度地提高了作物氮肥利用率（NUE），这将有利于促进作物产量的提升（表2）。Abalos 等[57]基于荟萃分析的研究表明，脲酶/硝化抑制剂使NUE 平均提高12.9%。张文学等[58]在水稻土壤中研究发现，与仅施用尿素处理相比，添加NBPT 后水稻地上部氮素回收率提高幅度为19.4%。Suter 等[59]研究发现，添加脲酶抑制剂促进了土壤中氮的固存。玉米盆栽试验表明，NBPT 与尿素协同施用后的NUE 为47.9%，较单施尿素处理增加幅度为18.6%[60]。施用NBPT 能够提高棉花产量、氮素吸收量和NUE，且与仅施用尿素处理相比，添加NBPT后NUE增加了16.8个百分点[61]。这主要是因为施用脲酶抑制剂在延缓尿素水解并减少NH3挥发的同时，也利于土壤氮素持续供应，更好地满足作物对氮素的需求[62]，进而提高作物对氮素的吸收利用。Huang 等[63]对中国农田土壤进行荟萃分析发现，脲酶抑制剂整体增加作物产量约4.7%。Linquist等[64]研究发现，脲酶抑制剂施用后水稻产量平均增加5.7%。与单施尿素处理相比，NBPT 配施尿素使作物产量平均增幅达5.3%[18]。Cantarella 等[26]综合96 个监测结果发现，施用NBPT 后小麦、牧草、大米、大麦、豆类、玉米、棉花和甘蔗的产量平均提高10.2%、8.4%、7.6%、6%、5.2%、4.1%、1.8%和-0.8%。

表2 脲酶抑制剂对作物产量的影响Table 2 Influences of urease inhibitors on crop yield

脲酶抑制剂对不同作物增产效果的差异可能与作物生长周期及其氮素营养特性和土壤温度、pH、降雨量等其他环境因素有关。NBPT配施尿素处理水稻产量随降雨增加呈非线性递减趋势，同时与仅施用尿素处理相比，添加NBPT 可使水稻产量增加8.9%～18.1%[65]。在热带强淋溶土中，NBPT配施尿素后玉米产量为7.17 t·hm-2，较单施尿素处理提高约10%[66]。Drury 等[56]研究发现NBPT 配施后玉米产量增加了3.33%～9.35%。Chatterjee[67]研究表明，NBPT 和尿素协同施用后显著增加冬小麦和甜菜产量，增幅分别为4.46%和6.23%。脲酶抑制剂在增加作物产量的同时，通常也会提高作物品质。盆栽条件下NBPT 配施尿素能提高28.3%～33.7%的油菜生物产量，并降低植株体内4.2%～32.6%的硝酸盐含量[68]。与单施尿素（300 kg·hm-2，以N计）处理相比，田间添加NBPT的尿素处理土豆产量增加42%，且以大果（>55 mm）和中果（35～55 mm）增产为主[69]。类似地，NBPT 配施尿素的处理小麦产量可增加15.4%，同时增加小麦蛋白10.1%[70]。然而，也有研究显示脲酶抑制剂并没有显著提高作物的品质。如Bryant 等[71]研究结果表明，施用包膜NBPT 的尿素并未使水稻籽粒中蛋白含量提高，反而略有降低。试验结果的不一致可能与水稻中蛋白含量受氮肥种类和水稻品种基因型影响有关[72]。

2 硝化抑制剂

2.1 作用机理

硝化作用是全球土壤氮循环的关键过程，其氨氧化过程是该反应的限速步骤。参与该过程的土壤微生物主要是自养的AOB 和AOA，且通常认为在中性、碱性和高氮投入或氮充裕的土壤条件下AOB 是驱动硝化过程进行的主体，而在酸性、氮含量相对较低的自然生态系统中AOA 发挥更为重要的作用[73]。氨在氨氧化菌氨单加氧酶（AMO）作用下被氧化为羟胺（NH2OH），随后在羟胺氧化还原酶（HAO）作用下氧化为亚硝酸[14]。大多数硝化抑制剂通过抑制AMO 活性来减缓硝化作用进程（图1）。其主要抑制作用机理：①直接与AMO 结合并相互作用，如硝基吡啶；②螯合AMO 中的辅酶因子Cu，降低其有效性，如DMPP；③底物氧化使AMO 失活，如乙炔。一般认为硝化抑制剂主要通过抑制氨氧化细菌微生物的活性来暂时阻止NH3氧化为羟胺（图1），进而延长在土壤中的滞留时间[74]，减缓硝化作用进程并降低该过程中N2O 排放，同时也降低了土壤中浓度及其淋洗风险[75]。因此，硝化抑制剂被推荐为减少农田土壤N2O 排放的重要措施之一[76]，并被广泛应用在各农业系统中[77]。

目前，DCD 和DMPP 是最为常见并已商业化应用的硝化抑制剂。有研究表明，DCD 具有抑菌作用而非杀菌功能，其主要通过暂时阻碍AOB 的生长和活性，限制其对的吸收和利用[78]。DCD 降解或抑制效能下降后，土壤AOB 将逐渐恢复活性并重新进行氨氧化过程。但也有研究发现，酸性土壤中一定浓度的DCD 可完全抑制AOA 的生长[79]。与DCD相比，DMPP 能够通过螯合AMO 中的Cu来阻碍AOB 对NH3的氧化反应，高效抑制AOB 生长和相关amoA基因的表达[80-81]，但对AOA 并无影响[82-83]。Shi 等[84]在菜田和草地土壤上的对比试验表明，DMPP 通过影响AOB 的丰度和代谢活性有效抑制碱性菜田土壤的硝化作用和N2O 排放，而对酸性草地土壤的硝化作用和硝化菌影响不显著，这与酸性土壤AOB 丰度较低以及DMPP作为一种杂环化合物可能被有机质所吸附，从而降低对氨氧化过程的有效抑制有关。同时，Li等[85]研究发现，DMPP 可直接抑制氨氧化和反硝化微生物活性进而有效抑制N2O的排放。Dong等[86]在大豆-玉米轮作系统中的研究结果表明，在培养49 d后DMPP 配施尿素显著降低了nirS基因丰度。Kou等[87]在设施菜田土壤中研究发现，DMPP 显著减少了nirS和nirK基因拷贝数，而DCD 对其无影响。DMPP 对不同细菌种群的影响依赖于土壤含水量，40% WFPS（土壤孔隙含水量）条件下施用DMPP降低了amoA、narG、nirK和nosZ基因丰度，而在80% WFPS 条件下，DMPP 对amoA基因丰度无显著影响，但增加了反硝化菌基因丰度[88]。然而，早期研究发现，DMPP 并未影响土壤硝酸盐还原酶和N2O 还原酶活性，这可能与施用氮肥的形态和土壤环境条件有关[89]。

2.2 环境和农学效应

2.2.1 对NH3挥发的影响

表3 硝化抑制剂对土壤NH3挥发损失的影响Table 3 Influences of nitrification inhibitors on soil NH3 volatilization

2.2.2 对温室气体N2O排放的影响

硝化抑制剂在降低土壤N2O 排放方面具有良好的效果（表4）。Qiao等[77]综合田间应用硝化抑制剂的试验结果发现，硝化抑制剂的施用平均减少N2O 排放达44%。Fan等[96]在陕西和山东两地菜田土壤中研究发现，添加硝化抑制剂DCD 后N2O 排放量分别降低了61%和46%。Zhang 等[97]在菜田土壤中也发现，与仅施用尿素处理相比，添加DCD 可减少田间6.2%的N2O 排放。Shamsuzzaman 等[98]开展的尿素与不同有机物料配比的研究结果显示，尿素+水稻秸秆、尿素+牛粪和尿素+鸡粪处理添加DCD 后，土壤N2O 排放量分别降低了40.6%、43.4%和24.5%。Dai等[99]在牧草土壤中研究发现，DCD 施用后N2O 排放总量减少52%～69%，主要归因于DCD 抑制了土壤AOB 的生长。与DCD 相比，DMPP 的施用量仅为DCD 的1/10，同时，连续3年的试验结果表明DMPP降低了49%的N2O排放量，而DCD 仅降低了26%[100]。类似地，在设施菜田土壤也发现DMPP 对减少N2O 排放、延缓氨氧化的效果均优于DCD[87]。在草地土壤中施用DMPP 能显著减少23%～33%的N2O 累积排放量[101]。在小麦-玉米轮作农田土壤中，尿素和尿素+DMPP 处理N2O 年累积排放量分别为4.49、2.78 kg·hm-2（以N 计），即DMPP减少了38%的N2O年排放量[102]。室内培养试验结果表明，与单施尿素处理相比，DMPP在石灰性土壤中（pH 7.9）减少N2O 累积排放量高达99.2%[103]。可见，在碱性条件下DMPP 对土壤硝化作用具有较高的抑制率[104]。与DMPP相比，DCD可在酸性土壤条件下显著降低N2O 排放量，而对中性和碱性土壤无显著影响[105]。

表4 硝化抑制剂对土壤N2O排放的影响Table 4 Influences of nitrification inhibitors on soil N2O emissions

通常，硝化抑制剂在降低N2O 排放的同时会增加NH3挥发损失（见2.2.1）。尽管NH3本身并不是温室气体，但其是N2O间接排放的重要来源之一[106]。有研究发现，挥发损失的NH3约有1%～5%经大气沉降、硝化和反硝化过程再次转化为N2O[107]。这意味着硝化抑制剂对N2O 的减排效应将随NH3排放量的负面效应的增强而相对减弱。考虑大气沉降的NH3对N2O的间接排放贡献，硝化抑制剂对N2O 排放的影响总体表现为-4.5～0.5 kg·hm-2（以N2O-N计）[94]。因此，未来研究应综合考虑硝化抑制剂对NH3挥发导致的N2O间接排放影响，以进一步准确综合评估和量化硝化抑制剂对N2O 的减排效应。此外，在土壤含水量较高（85%WFPS）的草地土壤中，与仅施用硫酸铵相比，DMPP 施入增加了16.4%的分子态氮气（N2）损失[108]。而Friedl 等[109]的研究结果显示，添加DMPP 减少牧场土壤70%以上的累积N2损失，这可能与DMPP限制了反硝化底物有效性并减少了异养呼吸造成的氧气消耗有关。因此，硝化抑制剂对分子态氮气损失及反硝化作用的影响还需要进一步深入探究。

2.2.3 对硝酸盐淋洗的影响

2.2.4 对作物氮肥利用率和产量的影响硝化抑制剂在降低土壤淋洗和N2O 排放的同时，还可提高作物产量（表5）和NUE（表6）。在尿素施氮量较低（23 kg·hm-2，以N 计）条件下，添加DMPP可增加32%的牧草干质量[125]。Li等[115]在水稻-油菜轮作区发现，DMPP 与尿素协同施用后均显著增加水稻和油菜籽的产量，产量增幅分别为5.3%和6.9%。Zhao 等[47]在华北平原小麦-玉米轮作体系2013—2014 年间的研究结果显示，与仅施尿素处理相比，添加DCD 尿素处理的小麦和玉米产量分别为6.7、8.9 t·hm-2，年平均增幅为9.1%。类似地，尿素配施DCD后小麦产量增加了7.9%[121]。不同地域菜田土壤试验结果表明，在湖南强淋溶土、陕西塿土、山东潮土、黑龙江黑土中添加DCD 的尿素处理蔬菜产量分别增加3.1%、6.6%、17.5%和17.6%[91]。DMPP 显著增加晚稻产量，平均增幅为15.1%，但对早稻无显著增产作用[126]。DMPP 与氮肥配施后显著增加萝卜和生菜产量，而对洋葱和菠菜产量无明显影响，甚至有降低趋势[127]。这可能与土壤环境条件、作物种类和生长周期不同等有关。例如，硝化抑制剂在酸性土壤中的NUE 显著高于中性和碱性土壤，这可能与硝化抑制剂在中性和碱性土壤更易增加NH3挥发损失有关[128]。大多数研究表明，硝化抑制剂施用在增加作物产量的同时，也会提高作物品质。与习惯施肥相比，施用含DCD 的水溶肥可增加黄瓜中26%的可溶性糖含量，减少温室黄瓜硝酸盐含量达21.6%[129]。DCD 与氮肥协同配施也可增加日光温室番茄近20%的产量，并显著降低番茄果实中的硝酸盐含量[130]。与DCD 类似，DMPP 可降低菠菜中26%～84%的硝酸盐含量[131]，且施用含DMPP 的复合肥可显著增加黄瓜、西瓜产量，提高可溶性糖、维生素C 和氨基酸含量[132]。然而，施用硝化抑制剂也会产生一些负面效应。Yu 等[119]研究发现DMPP 尽管增加冬小麦的产量，却显著降低了冬小麦中粗蛋白含量。此外，2012年在新西兰发现，常年施用硝化抑制剂DCD 的干草中存在DCD 残留，并已在部分乳制品中检测到DCD，这极大增加了人们对食品安全的担忧[131]。

表5 硝化抑制剂对作物产量的影响Table 5 Influences of nitrification inhibitors on crop yield

表6 硝化抑制剂对氮肥利用率的影响Table 6 Influences of nitrification inhibitors on nitrogen utilization efficiency（NUE）

农田土壤较低的NUE 主要归因于与硝化作用相关的氮素损失，如硝酸盐的淋洗和反硝化作用[133]。因此，利用硝化抑制剂抑制向的转化，有助于降低土壤的淋洗并提高作物NUE。Raza 等[123]发现在尿素施氮量为220 kg·hm-2（以N计）时，尿素和尿素配施DCD 处理的小麦NUE 分别为31.2%和38.1%。在不同尿素施氮量下，与仅施用尿素处理相比，尿素配施DMPP 处理冬小麦NUE 提高4.9～20.1 个百分点，同时随着氮肥施用量的增加，DMPP 对冬小麦NUE 的提升作用逐渐下降[134]。在水稻氮肥利用率的研究中发现，连续两年试验中尿素和尿素+DMPP 处理NUE均值分别为35%和45%[124]。在针对油菜的研究中发现，尿素和尿素+DCD 处理NUE 分别为30.7%和56.9%[135]。也有研究发现菜田土壤中添加DCD 并未显著提高NUE[42]。与仅施用尿素相比，尿素配施DCD使番茄NUE 增加6.83 个百分点[122]。在草地土壤中，施用DCD 使NUE 明显增加[136]。不同农业生态系统中，硝化抑制剂对作物NUE 的影响与作物种类及生长周期、抑制剂种类、肥料类型及施用量、土壤温度和水分等环境因子有关。