紫茎泽兰水提物对两种旱地作物种子萌发及幼苗生长的化感效应

杨云海,赵 芸,范黎明,王凯博,2,苏发武,查友贵,叶 敏*

(1.云南农业大学 云南生物资源保护与利用国家重点实验室,云南 昆明 650201；2.云南省农业科学院 环境资源与植物保护研究所,云南 昆明 650201)

紫茎泽兰(Ageratinaadenophora)是菊科泽兰属多年生草本植物,原产于中美洲墨西哥至哥斯达黎加一带[1],自20世纪40年代左右,由东南亚边境地区经云南南部传入后,在我国迅速蔓延扩散,现已广泛分布于云南、贵州、广西、西藏等西南地区,已成为我国主要的恶性入侵杂草之一[2-4]。紫茎泽兰入侵定植后,由于其较强的生长和繁殖能力,很难被清除,可迅速地侵占农田、林地、天然草地、路边和闲置空地等,与本土植物争夺水、肥、阳光等,严重影响本土植物的生长;在入侵天然草地后,牲畜误食一定量的紫茎泽兰后会出现腹泻、脱毛等症状,严重时甚至会死亡[5,6];紫茎泽兰给当地的农、林、畜牧业生产造成了严重的经济损失和生态环境的“绿色灾难”[7,8]。因此,探究紫茎泽兰侵入农田后对旱地作物生长的影响,对农业经济发展具有重要意义。

近年来,入侵植物的化感作用引起了科研人员的广泛关注。据报道,化感作用是导致外来植物成功入侵的重要因素[9-11]。对紫茎泽兰化感作用方面的研究始于20世纪80年代,主要集中于澳大利亚、印度和中国等,越来越多的研究发现化感作用是紫茎泽兰入侵后逐渐发展成为单种优势种群的重要原因[12,13]。已有大量研究表明紫茎泽兰的水提取物可抑制多种植物的生长发育,对植物有强烈的化感抑制作用。张学文等[14]研究发现紫茎泽兰不同部分的化感作用有明显差异,在相同浓度下紫茎泽兰地上部分水浸提液的化感作用明显强于地下部分。熊勇等[15]发现紫茎泽兰茎、叶的水提取物对供试的玉米、水稻种子发芽率和幼苗根长、株高均有不同程度的影响,水提液的浓度越大,化感抑制作用越强。此外,紫茎泽兰地上部的水浸提液对紫花苜蓿、非洲狗尾草、白三叶、鸭茅等7种牧草种子的萌发和幼苗生长均表现出强烈的抑制作用[16]。迄今关于紫茎泽兰地上部分化感作用的研究主要局限于水提液,而有关水提液中有机溶剂萃取物的化感作用研究尚鲜有报道。本文以旱地常见的单子叶植物小麦和双子叶植物绿豆为供试作物,用不同有机溶剂萃取紫茎泽兰地上部分的水提液,研究了不同极性萃取物对两种作物种子萌发和幼苗生长的化感作用,以期为评估紫茎泽兰对旱地作物生长的影响提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 紫茎泽兰植物材料的采集 2018年2月在云南省昆明市富民县附近采集紫茎泽兰植物材料,摘取高度几乎相同且无病虫害的紫茎泽兰地上部分,放置于阴凉、通风和干燥的地方,阴干后粉碎备用。

1.1.2 供试作物种子 绿豆(Triticumaestivum,品种为极早绿珍珠二号)、小麦(Vignaradiata,品种为烟农0428),购于昆明市的种子公司。

1.1.3 主要试剂 石油醚(分析纯,天津化学试剂有限公司)、乙酸乙酯(分析纯，西陇化工股份有限公司)、正丁醇(分析纯，科安隆博华天津医药化学有限公司)、丙酮(分析纯，重庆川东化工有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 紫茎泽兰地上部分各萃取相提取液的制备 称取500 g阴干粉碎的紫茎泽兰地上部分,按1∶5(w/w)的固液比加入蒸馏水,静置浸泡24 h,采用超声波水浴(超声波频率为35 kHz,功率为500 W)辅助提取30 min,然后过滤，得滤液；再将过滤后的残渣重复上述操作,合并两次提取所得的滤液,得到固液比为1∶10(w/w)的紫茎泽兰地上部分水提液。采用溶剂极性梯度萃取法,按溶剂极性从小到大的顺序依次用等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇将所得的水提液各萃取3次,合并相应的萃取液；将各有机溶剂萃取液和剩余水相用旋转蒸发仪减压浓缩,得到相应提取物的浸膏。将所得浸膏分别装入棕色广口瓶中,密封保存于4 ℃冰箱，备用。

1.2.2 紫茎泽兰提取物对小麦和绿豆种子萌发和幼苗生长的影响测定 称取一定量的各有机溶剂萃取物浸膏和剩余水相浸膏,用8%的丙酮水溶液对有机溶剂萃取物浸膏进行稀释,用蒸馏水对水相浸膏进行稀释,分别配制浓度为1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 mg/mL的水溶液,保存备用。

本实验主要采用烧杯-滤纸培养法测定植物种子的发芽率、幼苗的茎长及根长等,作为化感作用强度的生物测定指标[17-19]。选取大小相对一致且籽粒饱满的小麦和绿豆种子,用75%的酒精浸泡2 min,然后用蒸馏水多次反复冲洗,将种子自然阴干,放置于底部垫有两层定性滤纸的烧杯中,每个烧杯中分别整齐地放入小麦和绿豆种子8粒,并加入3 mL配制好的各浓度水溶液,使之刚好浸没种子体积的1/3。以加入8%丙酮的水溶液作为有机溶剂萃取液的空白对照,剩余水相处理以蒸馏水作为空白对照。用塑料保鲜膜封闭烧杯，并用大头针在保鲜膜上扎孔10个,以保证空气流通并减少水分快速蒸发。将烧杯放入光照培养箱内进行培养,光照培养箱设置：白天温度26.5 ℃,光照时间14 h,光照强度11000 lx；夜晚温度26.0 ℃,光照时间0 h,光照强度0 lx。培养5 d后,测定两种作物种子的最终萌发率、茎长、根长(小麦测量最长根)、根数。本实验每个处理设置6次重复。

1.3 计算方法

1.3.1 植物种子最终萌发率的计算 供试植物种子的最终萌发率(FG)和发芽化感效应指数(RI)采用康小武等[20, 21]报道的方法进行计算，公式如下:

FG(%)=发芽种子总数/供试种子总数×100

RI(%)=1-C/T(T≥C),RI=T/C-1(T

上式中：C为对照值；T为处理值;RI为化感效应指数。当RI>0时表现为促进作用；当RI<0时表现为抑制作用；RI的绝对值越大，则作用强度越强。

1.3.2 根长、苗高、根数抑制率的计算 关于紫茎泽兰地上部分提取物不同浓度水溶液对小麦、绿豆种子根长、苗高和根数的影响,参照施蕊等[22]报道的方法计算抑制率(IR),计算公式如下:

上式中：Ti为各浓度提取物的处理值；T0为空白对照值。当IR>0时表示具有抑制作用;当IR=0时表示无作用;当IR<0时表示具有促进作用。

1.4 数据统计方法

用SPSS 22.0数据处理软件处理实验数据,结合LSD检验进行单向ANOVA分析, 评价处理间的差异显著性和重复间的离散度。采用Oringin 9.1进行图形绘制。

2 结果与分析

2.1 紫茎泽兰地上部分各萃取物对小麦和绿豆种子萌发的影响

紫茎泽兰地上部分各萃取物对农作物小麦、绿豆种子发芽率及发芽化感效应指数的影响结果见表1,其中CK为对照组。

表1 紫茎泽兰地上部分各萃取物对受试作物种子萌发的影响

从表1可以看出：丙酮对受试作物种子的萌发没有影响,因此丙酮可以作为配制萃取物的稀释溶剂；各有机溶剂萃取物对小麦种子的萌发有明显的抑制作用,总体上表现为石油醚萃取物>乙酸乙酯萃取物>正丁醇萃取物>剩余水相；在相同溶剂下发芽率随各有机萃取物浓度升高而逐渐降低。在1.25 mg/mL浓度下,各萃取物处理后的小麦种子发芽率与对照相比无显著差异。当石油醚和乙酸乙酯萃取物的浓度为10.00 mg/mL时,小麦种子均没有萌发;正丁醇萃取物处理的小麦种子萌发率为50.00%,剩余水相为91.67%。在20.00 mg/mL浓度下,石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取物能完全抑制小麦种子的萌发,而剩余水相处理后仍有91.67%的萌发率,与空白对照(萌发率为100.00%)相比没有明显差异。各有机溶剂萃取物对双子叶植物绿豆种子发芽的抑制活性低于对单子叶植物小麦的抑制活性。10.00 mg/mL以上浓度的石油醚萃取物能完全抑制绿豆种子的萌发；当乙酸乙酯和正丁醇萃取物浓度为20.00 mg/mL时绿豆种子均没有萌发；经其余各有机溶剂萃取物处理后绿豆种子的发芽率均为100.00%；剩余水相不影响绿豆种子的萌发。综上所述,对受试作物种子萌发有抑制活性的物质主要集中于石油醚和乙酸乙酯部分。

2.2 紫茎泽兰地上部分各萃取相对小麦和绿豆幼苗生长的影响

2.2.1 紫茎泽兰地上部分各萃取相对小麦幼苗生长的影响 由图1可知,经各萃取液处理的小麦种子在萌发后,其幼茎长度与萃取物浓度总体上呈负相关,总体抑制作用表现为石油醚>乙酸乙酯>正丁醇>剩余水相。在1.25 mg/mL浓度条件下,经石油醚和乙酸乙酯处理后小麦幼茎长度分别为42.78和57.00 mm,与对照(110.17 mm)相比有显著差异(P<0.05);而经正丁醇和剩余水相处理后小麦幼茎长度分别为106.71和108.29 mm,与对照相比无显著差异。当浓度大于5.00 mg/mL时,石油醚和乙酸乙酯对小麦幼茎生长的抑制率均大于90.00%,正丁醇萃取相的抑制率为53.10%,但剩余水相的抑制率仅为22.52%。当石油醚和乙酸乙酯萃取物的浓度为10.00 mg/mL时它们完全抑制小麦幼苗的生长；20.00 mg/mL的正丁醇萃取相完全抑制小麦幼茎的生长；剩余水相的抑制率为68.84%。

如图2所示,经同种溶剂相同浓度处理后,它们对小麦幼根生长的抑制作用大于对幼茎的抑制作用,这可能与根先接触化感物质有关。经2.50 mg/mL以上浓度的石油醚萃取相处理后小麦幼根均未生长,根长抑制率均为100.00%;乙酸乙酯萃取物的抑制效果次之,其25.00 mg/mL处理能完全抑制小麦幼根的生长;正丁醇萃取物对小麦幼根的抑制效果略低于石油醚和乙酸乙酯萃取相,20.00 mg/mL的浓度才能使小麦种子不分化出幼根;经剩余水相20.00 mg/mL处理后小麦根长为6.49 mm,抑制率为91.13%,与其余有机溶剂萃取相相比抑制效果最差,但与对照相比仍有显著差异(P<0.05)。

从图3可以看出,石油醚、乙酸乙酯萃取物在低浓度时能增加小麦幼根的数量。正丁醇萃取相对小麦幼根数量的促进作用随浓度的增加而逐渐增大,在5.00 mg/mL时促进效果最明显,与对照相比幼根数量增加了11.96%；尔后随浓度增加,其促进作用减弱，抑制作用增强。经剩余水相部分处理后的小麦幼根数量与水溶液浓度呈正相关,剩余水相的浓度越高,小麦幼苗分化出的根数越多。究其原因，可能是因为各萃取物抑制小麦幼根的生长,小麦植株通过改变体内的激素来增加幼根的数量,以吸收足够的营养物质来保证植株的正常生长。

图1 紫茎泽兰地上部分有机溶剂萃取物对小麦幼茎生长的影响

2.2.2 紫茎泽兰地上部分各萃取物对绿豆幼苗生长的影响 本试验结果显示,在相同处理浓度下,紫茎泽兰地上部分各萃取物对双子叶植物绿豆的抑制作用大于对单子叶植物小麦的抑制作用,且各萃取相对绿豆幼苗生长的抑制作用表现为石油醚>乙酸乙酯>正丁醇>剩余水相。由图4可知：当浓度大于2.50 mg/mL时，石油醚萃取相物质能完全抑制绿豆幼茎的生长分化,其抑制作用显著强于乙酸乙酯、正丁醇和剩余水相。绿豆的幼茎长度与乙酸乙酯萃取相呈现明显的浓度效应关系,经1.25 mg/mL处理后绿豆幼茎长度为85.02 mm,抑制率为26.39%，而10.00 mg/mL乙酸乙酯萃取相对绿豆幼茎的抑制率达到100.00%。正丁醇萃取相对绿豆幼茎生长表现出“低促高抑”现象,当浓度为1.25和2.50 mg/mL时，绿豆幼茎长度与对照相比分别增加了2.02%和4.08%;尔后随正丁醇萃取液浓度增加,其抑制作用逐渐增强,在20.00 mg/mL处理下绿豆幼苗不生长。剩余水相处理对绿豆幼茎生长的抑制作用随处理浓度增加而逐渐增强,但抑制效果弱于石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取相,其20.00 mg/mL浓度处理对绿豆幼茎生长的抑制率仅为52.36%。

图2 紫茎泽兰地上部分有机溶剂萃取物对小麦幼根生长的影响

图3 紫茎泽兰地上部分有机溶剂萃取物对小麦幼根数量的影响

由图5可知,各萃取物对绿豆幼苗根长的抑制效果与对其幼苗茎长的抑制效果表现出一致性,均具有较强的浓度依赖效应。石油醚萃取物对绿豆幼根生长的抑制效果最好,1.25 mg/mL的抑制率为77.18%,浓度大于2.50 mg/mL能使绿豆不分化出幼根。乙酸乙酯萃取相的抑制效果稍弱于石油醚,绿豆幼根在1.25 mg/mL处理下长度为66.25 mm,抑制率为25.70%；此后随水溶液浓度升高,其抑制作用逐渐增强,10.00 mg/mL的抑制率达100.00%。经正丁醇萃取物处理后的绿豆幼根长度与溶液浓度呈负相关,经1.25 mg/mL处理后绿豆幼根长度为79.38 mm,抑制率为10.91%；此后随浓度增加幼根长度缩短,10.00 mg/mL完全抑制绿豆幼根生长。剩余水相对绿豆幼根长度的抑制效果最差,抑制率最大为68.43%；当其浓度为1.25 mg/mL时绿豆幼根长度为87.75 mm,与对照(89.07 mm)相比没有显著差异。

图4 紫茎泽兰地上部分有机溶剂萃取物对绿豆幼茎生长的影响

3 讨论

紫茎泽兰植株中含有大量具有化感活性的天然产物,在自然条件下水溶性的化感活性物质可经雨水、露水等的淋溶作用滴落在土壤里发挥化感生态学效应[10,23],当积累到一定量时能抑制周围植物种子萌发和幼苗、幼根生长,这些化感物质均会使邻近植物的生长发育受到影响,进而失去与紫茎泽兰的竞争力[24-27]。

图5 紫茎泽兰地上部分有机溶剂萃取物对绿豆幼根生长的影响

本课题组前期对紫茎泽兰化感活性物质的活性进行了大量的系统研究,发现紫茎泽兰地上部分水提物对植物种子和幼苗的生长具有生物抑制活性。为分离和鉴定紫茎泽兰地上部分提取物中的化感活性物质,本文采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇对紫茎泽兰水提液进行初步萃取分离。试验结果表明：各萃取相对小麦和绿豆这两种作物均有抑制作用,且对幼苗生长的抑制作用强于对种子萌发的抑制作用;不同有机溶剂萃取物对两种植物的抑制效果表现为石油醚萃取相>乙酸乙酯萃取相>正丁醇萃取相>剩余水相;同种溶剂萃取物在同一浓度下处理两种作物种子,对绿豆幼茎生长的抑制作用大于对小麦幼茎的抑制作用,而小麦幼根的敏感程度高于绿豆幼根,说明紫茎泽兰提取物对小麦和绿豆不同部位的影响程度不同。各萃取物对小麦幼根的抑制效果总体上大于对幼茎的抑制效果,且呈现明显的浓度效应,即随提取物浓度升高,对幼根和苗高的抑制作用增强。其中石油醚萃取物的抑制活性最好,其10.00 mg/mL处理能完全抑制小麦幼茎生长,2.50 mg/mL处理能使小麦幼根不分化。乙酸乙酯萃取物的抑制作用次之,其10.00 mg/mL处理能使小麦幼茎不生长,5.00 mg/mL处理对幼根的抑制率为100.00%。有机溶剂各萃取物对小麦幼根数量则表现为“低促高抑”效应。对于双子叶植物绿豆而言,不同有机溶剂萃取物对其的抑制作用与小麦呈现一致性,石油醚萃取物的抑制活性最强,其2.50 mg/mL处理完全抑制绿豆幼茎、幼根的生长;乙酸乙酯的抑制活性次之,其2.50 mg/mL处理对绿豆幼茎、幼根的抑制率分别为55.91%和52.99%,而10.00 mg/mL处理完全抑制绿豆幼苗生长。正丁醇萃取物对绿豆幼茎生长呈现低浓度促进、高浓度抑制的效应。

综上所述，紫茎泽兰地上部分水提液中各极性萃取物对小麦和绿豆种子萌发和幼苗生长均有化感抑制作用,并且活性物质主要集中在石油醚萃取相部分。如果紫茎泽兰侵入农田，则将对某些旱地作物的生长产生严重的负面影响。关于紫茎泽兰水提液中具体起化感作用的活性成分及其作用机制,尚有待进一步研究。