超声引导下腔内注射雷公藤甲素纳米粒治疗兔类风湿关节炎的实验研究

林娇娇 苏立阳 曾雅婷 罗玮雯 李拾林

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以侵蚀性关节炎为主要临床表现的慢性自身免疫性疾病，部分患者以寡关节受累为主，全身用药效果欠佳，关节腔内注射给药是常用的临床治疗手段，在减轻全身副作用的同时又能保证局部达到有效药物浓度。雷公藤甲素（triptolide，TP）是雷公藤木质部提取的二萜类脂溶性化合物，具有抗炎、抗肿瘤及免疫调节等作用，可用于RA的治疗［1］。但TP治疗RA的生物利用度低，为达到疗效临床常增加剂量，致伴随的副作用风险也增加［2］。纳米粒在实现药物靶向递送的同时，还可以提高药物的生物利用度。本研究以固体脂质纳米粒作为载药工具制成TP纳米粒（triptolide nanoparticle，TPN），于超声引导下兔膝关节腔内注射TPN治疗兔抗原诱导关节炎（antigen-induced arthritis，AIA），并评估其疗效，旨在探讨其临床价值。

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材料与方法

一、实验动物

选取成年健康新西兰大白兔27只，体质量2.3～2.7 kg，购自福建省连江玉华山自然生态农业试验场，许可证号：SCXK（闽）2014-0001，分笼饲养于泉州医学高等专科学校动物房恒温（24～26℃）环境中。

二、主要实验试剂及仪器

1.主要试剂：TP（纯度＞99%，北京百灵威科技有限公司）；倍他米松（BS，瑞士Mreck Sharp&Dohme AG公司）；完全弗氏佐剂、卵蛋白（美国Sigma公司）；山嵛酸甘油酯、甘油棕榈酸硬脂酸酯（国药集团化学试剂有限公司）；单硬脂酸甘油酯、聚氧乙烯40醚氢化蓖麻油（山东优索化工科技有限公司）；棕榈酸（青岛优索化工科技有限公司）。

2.主要仪器：日立Preirus彩色多普勒超声诊断仪，线阵探头，频率为18 MHz；Nano-ZS90 Zetasizer激光粒度仪（英国Malvern公司）；DF-101S恒温加热磁力搅拌器（河南省巩义市予华仪器有限责任公司）；全自动生化分析仪（德国Beckman公司）。

三、实验方法

1.兔膝关节滑膜炎病理评分比较：TP组滑膜炎病理评分（5分）低于对照组（10分），差异有统计学意义（Z=-2.530，P＜0.05），以轻度滑膜炎为主；TPN组和BS组滑膜炎病理评分（1分、0分）均低于TP组，差异均有统计学意义（Z=-2.082、-2.687，均P＜0.05），TPN组与BS组比较差异无统计学意义。见图2 A1～A3。

2.建立AIA兔动物模型：分为基础致敏和末次免疫两个环节。基础致敏：先将20 mg/ml卵蛋白生理盐水与等量完全弗氏佐剂混匀，现配现用，每只兔每周于肩胛区皮下注射混合液1.0 ml，连续注射3周；末次免疫：于第4周向兔膝关节腔内注射0.2 ml卵蛋白溶液［4］。末次免疫1周后行超声检查提示膝关节滑膜组织增生明显及滑膜血流信号较丰富，即为模型建立成功。

3.分组及超声引导下腔内注射：27只兔随机分成4组，在末次免疫1周后，取2%戊巴比妥钠（1.25 ml/kg）注入兔耳缘静脉麻醉后，90°屈曲兔膝关节，TPN组、TP组和BS组（各7只）分别于超声引导下使用1.0 ml注射器向兔膝关节腔内注射TPN、TP、BS溶液各0.2 ml，其中TP溶液和TPN溶液中TP含量均为0.1 mg/ml，连续给药4周，每周1次。对照组（6只）仅行关节腔穿刺而不注射任何药物。

四、观测指标

1.各组兔膝关节滑膜增生超声评分比较：末次给药1周后对照组滑膜增生超声评分以2、3分为主，TP组以1、2分为主，BS组和TPN组以0、1分为主，见表2和图1 A1～A4。TP组滑膜增生超声评分低于对照组（Z=-2.726，P＜0.05），BS组和TPN组滑膜增生超声评分均低于TP组，差异均有统计学意义（Z=-2.176、-2.360，均P＜0.05），BS组与TPN组比较差异无统计学意义。

在此基础上，1984年8月，我国第一个物流专业研究团体——中国物流研究会成立。1989年4月，由中国物资经济学会承办的第一个国际物流会议——第八届国际物流会议在北京举办。据描述：这样的国际物流会议是第一次在中国举办。

表1 Szkudlarek超声评分标准

五、统计学处理

企业外宣翻译一方面要客观、真实、准确地反映产品质量特征;另一方面，要跨越目的语与源语之间存在的语言文化差异，运用变通的翻译方法，拉近与目的语读者的心理距离，使他们最大限度地产生对产品的认同感，才能达到积极良好的宣传效果，吸引更多的潜在客户。例4原文中列举了企业获得的许多权威认证来凸显企业的质量优势，是典型的“第一人称视角”，这种做法在西方人看来却有重复自夸的嫌疑，效果可能适得其反。译文取质量、效率和顾客满意度三点，简化翻译，更能实现宣传功能。

结 果

一、各组兔总体情况

2.兔膝关节骨侵蚀病理评分比较：TP组、TPN组和BS组骨侵蚀病理评分（2分、1分、1分）均较对照组低（10分），差异均有统计学意义（Z=-2.216、-2.505、-2.505，均P＜0.05），TP组、TPN组和BS组间的比较差异无统计学意义。见图2 B1～B3。

二、各组兔膝关节的超声评分比较

关节腔内连续给药4周，观察各组兔一般情况，测量其膝关节直径。每周行膝关节超声检查，根据Szkudlarek超声评分系统［5］对各组兔膝关节的滑膜增生、滑膜血流信号及骨侵蚀情况进行评分，评分标准见表1。在末次给药的1周后取耳缘静脉血，行生化全套检测，测量指标包括：总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、间接胆红素（IBIL）、谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、血清尿素氮（BUN）及血清肌酐（Scr），比较各组兔肝、肾功能的差异。然后经耳缘静脉使用空气栓塞法处死兔，取兔膝关节制作病理切片并行HE染色，观察滑膜增生和骨侵蚀情况并进行病理评分，滑膜增生（滑膜炎）的病理评分根据Krenn评分标准［6］，以滑膜衬里层、滑膜细胞的数量、炎症浸润程度3个指标分为无、轻度、重度滑膜炎；同时取所有兔的肝、肾进行病理检查。

表2 末次给药1周后各组膝关节滑膜增生的超声评分结果 只

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2.各组兔膝关节滑膜血流超声评分比较：末次给药1周后TP组、TPN组和BS组滑膜血流超声评分以0分为主，均较对照组低，差异均有统计学意义（Z=-3.033、-2.842、-3.277，均P＜0.01）；TP组、TPN组和BS组间比较差异无统计学意义。见表3和图1 B1～B4。

表3 末次给药1周后各组膝关节滑膜血流的超声评分结果 只

3.各组兔膝关节骨侵蚀超声评分比较：末次给药1周后TP组、TPN组和BS组的骨侵蚀超声评分以0分和1分为主，均较对照组低，差异均有统计学意义（Z=-2.948、-3.141、-3.210，均P＜0.01）；TP组、TPN组和BS组间比较差异无统计学意义。见表4和图1 C1～C4。

表4 末次给药1周后各组膝关节声骨侵蚀的超声评分结果 只

图1 各组兔膝关节超声表现

三、各组兔膝关节的病理评分比较

1.制备TPN：参考文献［3］，采用微乳法将TP、酯类等原材料放在集热式恒温加热磁力搅拌器中加热熔融并磁力搅拌，然后缓慢滴加超纯水，待形成有淡蓝色乳光的微乳后，继续磁力搅拌，迅速用4℃冰水冷却固化，磁力搅拌100 min，样品置于冰箱4℃保存。

所有兔在末次免疫后的第2天均出现膝关节肿胀皮温升高，行走受限；在注射给药1周后，TPN组、BS组和TP组兔膝关节直径均明显减小。所有兔一般情况可，体质量均未见明显减轻，末次给药1周后血生化检查提示各组TBIL、IBIL、DBIL、AST、ALT、BUN及Scr均无明显异常。所有兔肝、肾病理检查均提示肝、肾细胞形态正常，排列良好，未发现异常改变。

教师要借助“一题多解”引导学生全面地分析问题、多角度地审视问题，帮助学生形成良好的思维习惯。学生的思维具有发散性，会不拘泥于一种途径、一种方法，教师要通过情境的创设鼓励学生从不同角度、不同方向去思考问题。当学生的思维遇到障碍时，教师还要有意识地引导学生从反方向去思考问题，探求出新思路、新方法。

图2 各组膝关节滑膜和骨病理图（HE染色，×40）

四、相关性分析

兔膝关节滑膜增生超声评分和骨侵蚀超声评分与其病理评分均呈正相关（r=0.832、0.859，均P＜0.001）。

讨 论

目前认为RA的免疫发病机制是在基因和环境共同影响下，自身免疫被激活，自身反应性T细胞分化为致病性T细胞亚群，在一系列免疫调节细胞和细胞因子的共同作用下，引发炎症级联反应，最终导致关节炎［7］。TP是中药雷公藤的主要活性成分，其可以通过诱导致病性T细胞凋亡、衰减核内转录因子NF-κB活性和降低促炎细胞因子水平等改善滑膜炎症、减轻骨破坏，同时还可抑制RA血管翳生成［8］。本实验结果发现兔关节腔内注射TP后膝关节滑膜炎和骨破坏情况均明显改善，说明腔内注射TP治疗RA有一定疗效。

使用中草药治疗疾病最大的挑战是吸收不良、生物利用度低，常需要增加剂量才能达到理想疗效，但伴随的副作用风险也随之升高［2］。随着纳米技术的发展，纳米粒在提高药物生物利用度的同时还可以实现药物的靶向递送，被广泛应用于载药系统。研究［9］指出纳米药物可以选择性地将药物递送并保留在发炎的滑膜组织中，利于药物吸收，同时减少全身潜在副作用。且脂质纳米粒的生物相容性好，能有效提高TP的生物利用度，实现缓释控释，同时保护TP不被关节腔内的酶类降解，从而减少剂量依赖性毒性［10］。最近研究［11］表明，肽修饰的脂质体递送可以调节免疫细胞因子，提高自身免疫性关节炎的治疗指数，增强疗效的同时降低了全身性暴露风险［12］。目前局部治疗RA最常用的药物是糖皮质激素，其能迅速减轻疼痛，有效控制炎症，但后期复发率高，易导致感染、骨质疏松等并发症。已有研究［3］已证实采用微乳法制备TPN，包封率更高且能有效降低TP的亚急性毒性，具有良好的安全性，给药4周后所有兔均未发现明显肝、肾副作用。本实验结果显示，关节腔内注射TPN治疗RA的效果明显优于TP，效果与BS相当，TPN或可成为局部治疗RA的备选药物。

传统的腔内注射进针方法主要是靠关节表面的骨性标志结合触诊来定位，具有盲目性。本实验使用超声引导下腔内注射给药，所有兔均未出现穿刺并发症等情况。相比其他影像引导技术，超声引导因无辐射且能够实时调整穿刺路径及走向，使针尖准确位于关节间隙内，从而避开周围血管、肌腱和神经等，减少穿刺损伤，确保药物进入关节腔。研究［13］认为肌骨超声对RA病理特征的评价效能与MRI相当，且超声观测滑膜血流信号与C反应蛋白、红细胞沉降率、类风湿因子均呈正相关（r=0.623、0.498、0.591，均P＜0.05），有助于评估疾病的活动性。郑擎等［4］应用高频超声于末次免疫后1周内检测到AIA模型兔关节滑膜增厚，本实验结果与之相符，早于血清中的血管内皮生长因子和TNF-α明显上升时间（2～6周），可见超声早期诊断RA的敏感性更高。研究［14］发现超声检查结果较疾病活动的血清学指标与组织学评分相关性更好，尤其是在疾病早期阶段。本实验兔AIA模型在末次免疫后第2天兔膝关节均出现明显肿胀，超声检查下可见滑膜增生并随时间逐渐进展，滑膜血流较丰富，4周后开始出现骨破坏。在注射药物治疗后，除对照组外其他各组兔膝关节滑膜炎及骨侵蚀情况均有明显好转，且滑膜炎和骨侵蚀的超声评分与病理评分均具有良好的相关性（r=0.832、0.859，均P＜0.001）。由此可见超声检查评估RA患者关节炎情况准确可靠，可以用于关节炎的早期诊断和疗效监测中。

在临床上，糖尿病是一种常见的多发病，其中以2型糖尿病最为多见，占比约为95%左右。针对此类患者，临床单独采用胰岛素加以治疗时，无法有效控制其血糖水平[1]。而作为一种噻唑烷二酮类降糖口服药，吡格列酮可保护胰岛β细胞，且可增加胰岛素敏感性，因而可发挥有效的血糖控制效果[2]。因此本文随机抽取我院收治的80例糖尿病患者，随机分为2组，各40例，即对糖尿病采用二甲双胍与吡格列酮联合治疗的临床价值做了探讨，现报道如下。

本实验的局限性：①纳入的兔AIA模型样本量相对较少，后期还需进行更大样本的研究，以及关节腔内药物代谢动力学的研究；②本实验仅观察至给药4周后，未进行长期疗效对比。

综上所述，对于寡关节受累的兔AIA，超声引导下关节腔内注射TP或可成为治疗关节炎的新方法，尤以TPN疗效更显著；超声在评价滑膜炎与骨侵蚀情况上与病理检查均具有较好的一致性，可作为评估早期关节炎及随访治疗效果可靠的影像学手段。