NK细胞、HA和Ⅳ-C水平与慢性丙肝患者肝纤维化的诊断效能

吴辉

（驻马店市中医院检验科，河南 驻马店 463000）

丙肝病毒（Hepatitis C virus，HCV）感染是导致慢性丙肝（Chronic Hepatitis C，CHC）发生的主要原因。研究显示，约85%的HCV感染患者会发展为CHC[1]。CHC作为一种慢性疾病，大部分患者早期无特异表现，但随着疾病发展，CHC可能会出现肝纤维化，逐步进展为肝硬化、肝癌，威胁患者生命安全[2]。病理诊断是评估CHC患者肝纤维化“金标准”,该检查方式虽可明确肝组织病变情况，评估肝纤维化发生及严重程度，但该技术属于有创检查，部分患者难以接受,且取部分肝组织也无法全面了解整个肝脏病变情况，应用仍有局限[3]。自然杀伤（natural killer cell，NK）细胞是重要免疫细胞，具有抗肿瘤、调节免疫等作用，有研究显示，NK细胞可分泌多种细胞因子调节免疫，提高个体对HCV的清除能力,且可能对预防CHC患者肝纤维化有一定作用[4]。透明质酸（hyaluronic acid，HA）、Ⅳ型胶原蛋白（Ⅳcollagen，Ⅳ-C）是临床判断肝纤维化常用指标，二者不仅可反映肝细胞损伤情况，还可参与肝纤维化过程[5]。结合NK细胞、HA、Ⅳ-C作用机制，推测三者可能与CHC患者肝纤维化有关，且对肝纤维化有一定诊断效能,但具体关系及诊断效能尚未明确。鉴于此,本研究重在分析NK细胞、HA和Ⅳ-C对CHC患者肝纤维化的诊断效能。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院2019年6月-2020年5月收治的81例CHC患者，男43例，女38例；年龄37～58岁，平均47.37±5.63岁；病程3～9年，平均6.30±1.13年。本研究的实施经本院医学伦理委员会批准，患者及家属均知情本次研究，且签署相关同意书。

1.2 入选标准 ⑴纳入标准：符合《丙型肝炎诊断标准(节选)》[6]中CHC诊断标准，且HCV检测呈阳性；精神正常，可配合研究；患者均无抗纤维化治疗史。⑵排除标准：合并恶性肿瘤；合并心、肝、肾等重要脏器病变；哺乳或妊娠期患者；智力障碍；合并其他感染性疾病；合并自身代谢性疾病。

1.3 方法

1.3.1 肝纤维化评估及分组 所有患者均接受肝穿刺活检,于彩超引导下,采用16G穿刺针（美国Bard公司，型号：MAGNUM型）快速进行肝组织穿刺术，取约1-2cm肝组织行病理诊断；参照肝纤维化病理诊断标准[7]评估，肝组织汇管区可见纤维化表现，或可见纤维间隔，或可见纤维间隔同时伴有小叶结构紊乱，或出现早期肝硬化表现等。将符合上述肝纤维化诊断标准患者纳为肝纤维化组，反之纳为无肝纤维化组。

1.3.2 外周血NK细胞、血清HA、Ⅳ-C检测⑴外周血NK细胞检测：采集患者清晨空腹肘部静脉血2ml，置于肝素抗凝管内；另取一个2ml试管，于试管内添加20μl CD3-FITC/CD（16+56）-PE/CD45-PerCP/CD19-APC四色试剂（购自深圳迈瑞医疗有限公司），再添加50μl抗凝血标本，充分摇匀后，放在室温下静置15min；于试管内添加450μl溶血剂，充分摇匀，放在室温下静置15min后，采用流式细胞仪（深圳迈瑞医疗有限公司，型号：BriCyte）测定NK细胞，淋巴细胞、T细胞分别用SSC/CD45、SSC/CD3设门圈定，NK细胞用淋巴细胞百分比表示。⑵血清HA、Ⅳ-C检测：采集患者清晨空腹肘部静脉血5ml，采用低速离心机（北京宏达恒业科技有限公司，型号：TD-420）以4000r/min转速离心10min，离心半径为10cm，采取血清用全自动生化分析仪（济南童鑫生物科技有限公司，型号：BK-1200），以化学发光发测定HA、Ⅳ-C水平，检测试剂盒购自上海透景生命科技股份有限公司，检验流程严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.3 基线资料调查 设计基线资料调查问卷，详细记录CHC患者基本信息，包括性别（男、女）、年龄、BMI、病程、合并症（糖尿病：空腹血糖水平≥7.0mmol/L；高血压：收缩压水平≥140mmHg，舒张压水平≥90mmHg）等。

1.4 统计学方法 采用SPSS23.0软件进行数据处理，计数资料以百分数和例数表示，组间比较采用χ2检验；全部计量资料均经Shapiro-Wilk正态性检验，符合正态分布的计量资料采用“”表示，组间比较采用独立样本t检验；经单项Logistic回归分析，并建立Logistic多元回归模型作影响分析；绘制受试者工作曲线（ROC），并计算曲线下面积（AUC），检验NK、HA和Ⅳ-C对CHC患者肝纤维化的诊断效能，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CHC患者肝纤维化发生情况81例CHC患者中19例发生肝纤维化，发生率为23.46%。

2.2 肝纤维化组、无肝纤维化组相关基线资料及NK细胞、HA、Ⅳ-C水平比较 肝纤维化组男43例，女38例；平均年龄47.52±5.21岁；平均病程6.25±1.12年；合并糖尿病5例,合并高血压6例；无肝纤维化组男33例，女29例；平均年龄（47.33±5.20）岁；平均病程6.31±1.11年；合并糖尿病12例，合并高血压13例；两组基线资料比较差异无统 计 学意义 （χ2=0.002、t=0.139、0.206、χ2=0.080、0.912，P=0.964、0.890、0.838、0.777、0.340）；肝纤维化组HA、Ⅳ-C水平高于无肝纤维化组,NK细胞含量低于无肝纤维化组,差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 肝纤维化组、无肝纤维化组相关基线资料及NK细胞、HA、Ⅳ-C水平比较（）

表1 肝纤维化组、无肝纤维化组相关基线资料及NK细胞、HA、Ⅳ-C水平比较（）

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2.3 NK细胞、HA、Ⅳ-C水平与CHC患者肝纤维化的关系回归分析 将NK细胞、HA、Ⅳ-C作为自变量（均为连续变量），将CHC患者肝纤维化情况作为因变量（1=肝纤维化，0=无肝纤维化），经Logistic回归分析结果显示，NK细胞升高可能是CHC患者肝纤维化的保护因子（OR＜1，P＜0.05），HA、Ⅳ-C升高可能是CHC患者肝纤维化的风险因子（OR＞1，P＜0.05）。见表2。

表2 NK细胞、HA、Ⅳ-C水平与CHC患者肝纤维化的关系回归分析结果

2.4 NK细胞、HA、Ⅳ-C水平诊断CHC患者肝纤维价值分析 将CHC患者肝纤维化发生作为状态变量，将NK、HA、Ⅳ-C细胞作为检验变量，绘制ROC曲线（见图1），结果显示，NK细胞、HA、Ⅳ-C水平单独及联合检测诊断CHC患者肝纤维的AUC分 别 为0.812、0.864、0.871、0.932，AUC均＞0.80，均有一定诊断效能，当三者cut-off值分别取83.230ng/ml、50.230ng/ml、8.555%时，诊断效能最佳。见表3。

图1 NK细胞、HA、Ⅳ-C水平单独及联合检测诊断CHC患者肝纤维的ROC曲线图

表3 NK细胞、HA、Ⅳ-C水平诊断CHC患者肝纤维价值分析结果

3 讨论

肝纤维化是指肝脏内结缔组织异常增生过程，不加以干预,病情长期发展可能会形成肝硬化，加重病情,提高治疗难度，患者不良预后风险增加。研究显示,肝纤维化是CHC进展为肝硬化必经过程,若能明确肝纤维化发生风险，对早期干预、预防肝硬化发生，改善患者预后意义重大[8]。因此，需寻求可早期评估纤维化风险指标,以指导临床早期干预、预防。

NK细胞属于天然免疫细胞,可增强免疫力，抵御病毒入侵，有研究显示，该细胞在HCV感染早期及发展过程具有重要作用。先天性免疫反应是个体在HCV感染后出现的第一防线,而NK细胞作为免疫细胞可杀伤被HCV感染的细胞，且分泌的干扰素-γ（IFN-γ）可抑制HCV病毒DNA复制，继而有效控制感染[9]。相关研究显示，HCV入侵后除会引发免疫反应外，还可能抑制某些免疫环节，促使HCV病毒逃脱免疫阻滞，造成IFN信号通路中断，导致免疫细胞无法阻止HCV入侵[10]。而NK细胞除可抑制HCV病毒入侵外，还可促进肿瘤坏死因子β、白介素10等细胞因子释放，发挥免疫调节作用，继而提高机体免疫力，增强对HCV病毒杀伤能力[11]。HA、Ⅳ-C是评估纤维化程度常用指标，其中HA是由肝间质细胞分泌而来，可被肝内皮细胞降解，当肝纤维细胞含量增加，或内皮细胞受损时，HA表达显著增高。有研究显示，相比较肝脏组织活检，HA更利于提示肝脏病变全貌,且可作为肝纤维化敏感指标[12]。Ⅳ-C是肝基底膜重要组成部分，可提示基底膜胶原更新率，参与肝窦毛细血管化形成过程,常被作为肝纤维化早期标志物[13]。结合NK细胞、HA、Ⅳ-C作用机制，推测三者可能与CHC患者肝纤维化发生有关。

本研究初步比较两组相关基线资料及NK细胞、HA、Ⅳ-C水平，后经Logistic回归分析结果显示，NK细胞升高可能是CHC患者肝纤维化的保护因子，HA、Ⅳ-C升高可能是CHC患者肝纤维化的风险因子,证实推测。进一步绘制ROC曲线发现,NK细胞、HA、Ⅳ-C水平诊断CHC患者肝纤维均有理想的价值，在三者cut-off值分别取83.230ng/ml、50.230ng/ml、8.555%时，可获得最佳诊断效能，且随着NK细胞含量的降低、HA、Ⅳ-C的升高，患者肝纤维化风险增加。针对此结果提出建议，对于入院时NK细胞降含量低、HA、Ⅳ-C水平升高的CHC患者，临床应尽早行病理诊断，以明确病变情况，早期干预。同时，本研究发现，NK细胞、HA、Ⅳ-C联合检测诊断CHC患者肝纤维价值高于各项单独检测，考虑未来可将三者结合观察，以提高患者整体获益。但本研究并未分析NK细胞、HA、Ⅳ-C三者相关性，研究存有局限，未来仍需展开前瞻性研究加以验证。

综上所述，CHC患者肝纤维化可能与患者NK细胞含量低、HA、Ⅳ-C水平升高有关，且NK、HA和Ⅳ-C对CHC患者肝纤维化有一定诊断效能，考虑未来可检测患者入院时NK细胞、HA、Ⅳ-C水平,辅助评估CHC患者肝纤维化风险并指导早期干预。